具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因
Summary
このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。
Abstract
ほとんどの真核生物RNAの処理は、具体的プレmRNA標的およびエフェクタードメインに結合するRNA認識モジュールを含むモジュラー構成とRNA結合タンパク質（RBPs）によって媒介されます。以前、我々は、RNA代謝を操作するために、様々な人工RBPsを操作するために使用されたプログラム可能なRNA結合足場を生成するために、ヒトPumilio 1にPUFドメインのユニークなRNA結合モードの利点をとっています。ここでは、詳細なプロトコルは、具体的には、標的遺伝子の選択的スプライシングを調節するように設計されたエンジニアースプライシング因子（のESF）を構築することが記載されています。プロトコル設計および構築物特定のRNA標的に対するカスタマイズPUF足場を、デザイナーPUFドメインおよびエフェクタードメインを融合させることによってESF発現プラスミドを構築する方法、およびどのように標的遺伝子のスプライシングを操作するためのESFを使用する方法を含みます。この方法の代表的な結果では、我々はまた、一般的なアッセイを記載していますスプライシングレポーターを用いたESF活性の測定、培養ヒト細胞におけるESFの適用、およびその後のスプライシング変化の影響が含まれる。このレポートの詳細なプロトコールに従うことにより、異なるタイプのオルタナティブスプライシング（AS）の調節のためのESFを設計および生成し、スプライシング調節を研究する新しい戦略および異なるスプライシングアイソフォームの機能を提供することが可能である。さらに、異なる機能ドメインを設計されたPUFドメインと融合させることにより、研究者はRNAプロセシングの様々なステップを操作するために特異的RNAを標的とする人工因子を設計することができる。
Introduction
ほとんどのヒト遺伝子は、選択的スプライシング（AS）が大きくゲノム1,2の符号化の複雑さを増加している別個の活動で複数のアイソフォームを生成するために受けます。 ASは、遺伝子機能を調節するための主要なメカニズムを提供し、それはしっかり異なる細胞及び発達段階3において、多様な経路を介して調節される、4。スプライシング誤は、ヒト疾患5、6、7、8の一般的な原因であるので、スプライシング規制を標的とすることは、魅力的な治療の経路となってきています。
主にスプライシング規制によって制御されているような代替エキソンのスプライシングエンハンサーまたはサイレンサーとして機能するプレmRNA中（のSRE）は、シス -Elements、スプライシング調節の簡易モデルによります。目ESEのSREは、具体的には、種々のトランス -actingタンパク質因子促進またはスプライシング反応3,9を抑制（ すなわち、スプライシング因子）を募集します。ほとんどのトランス -actingのスプライシング因子は、スプライシングを制御するためにその標的とエフェクタードメインを認識するために別の配列特異的RNA結合ドメインを持っています。最もよく知られた例は、エキソン包含10を促進するN末端RNA認識エキソンスプライシングエンハンサーと結合モチーフさ（Rrms）、およびC末端RSドメインを含むセリン/アルギニンリッチ（SR）タンパク質ファミリーのメンバーであります。逆に、のhnRNP A1は、RRMドメインを介しエキソンスプライシングサイレンサーに結合し、C末端グリシンリッチドメイン11を介しエキソン包含を阻害します。そのようなモジュラー構成を使用して、研究者らは、異なるeffecと特異的RNA結合ドメイン（RBD）を組み合わせることにより、人工的なスプライシング因子を設計することができなければなりませんスプライシングを活性化または阻害するドメインを含む。
そのような設計の鍵は、プログラム可能なRNA結合特異性を有する所定の標的を認識するRBDを使用することであり、これはTALEドメインのDNA結合様式に類似している。しかしながら、ほとんどの天然スプライシング因子は、弱い親和性で短いRNAエレメントを認識し、したがって予測RNA-タンパク質認識「コード」 12を欠くRRMまたはKホモロジー（KH）ドメインを含む。 PUFリピートタンパク質（ すなわち 、PUFドメイン）のRBDは、異なるRNA標的を特異的に認識するためのPUFドメインの再設計を可能にする独自のRNA認識モードを有する13,14。カノニカルPUFドメインは3つのα-ヘリックスの8つのリピートを含み、それぞれ8-nt RNA標的の単一塩基を認識する。第2のα-ヘリックスのある位置にあるアミノ酸の側鎖は、tのワトソン – クリック端と特異的な水素結合を形成するそのRNA塩基は、各リピートのRNA結合特異性を決定する（ 図1A ）。 PUF反復のRNA塩基認識のコードは、驚くほど単純であり（ 図1A ）、可能な8塩基の組み合わせを認識するPUFドメインの生成を可能にする（WeiおよびWang 15によって総説された）。
このモジュラー設計原理により、カスタマイズされたPUFドメインとスプライシング変調ドメイン（ すなわち 、SRドメインまたはGlyリッチドメイン）からなるエンジニアリングスプライシングファクター（ESF）の生成が可能になります。これらのESFは、スプライシングアクチベーターとして、または様々なタイプのスプライシング事象を制御するインヒビターとして機能することができ、ヒト疾患に関連する内因性遺伝子のスプライシングを操作するためのツールとして有用であることが判明している16,17 。一例として、Bcl-x遺伝子のスプライシングを特異的に改変するPUF-Gly型ESFを構築した抗アポトーシス長イソ型（Bcl-xL）をアポトーシス促進性の短いアイソフォーム（Bcl-xS）に変換する。 Bcl-xアイソフォームの比をシフトさせることは、いくつかの癌細胞を複数の抗癌化学療法薬16に感作させるのに十分であり、これらの人工因子が潜在的な治療薬として有用である可能性があることを示唆している。
既知のスプライシングエフェクタードメイン（ 例えば、 RSまたはGlyリッチドメイン）によるスプライシングの制御に加えて、改変されたPUF因子を用いて、新しいスプライシング因子の活性を調べることもできる。例えば、このアプローチを用いて、いくつかのSRタンパク質のC末端ドメインが異なるプレmRNA領域18に結合する場合、RBM4のアラニンに富むモチーフがスプライシング19を阻害し得ること、およびDAZAP1のプロリンが豊富なモチーフは、スプライシングを促進することができる20,21 </ SUP>。これらの新しい機能ドメインは、微調整のスプライシングには人為的な要因の追加タイプを構築するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートは、標的遺伝子の選択的スプライシングを操作できる人工的なスプライシング因子の設計と建設のための詳細な説明を提供します。この方法は、カスタマイズされた特異性を有するRNA結合足場を製造するために繰り返すPUFのユニークなRNA結合モードを利用します。それは、どちらかの活性化やスプライシングを抑制するために使用することができます。
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Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH助成金R01-CA158283とNSFCによってサポートされていましたZWYWへの補助金31400726は若い千の才能プログラムと中国の国家自然科学基金（補助金31471235と81422038）によって運営されています。 XYは、中国のポスドク科学財団（2015M571612）によって運営されています。
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
Referencias
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