인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할
Summary
이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.
Abstract
대부분의 진핵 생물 RNA의 프로세싱은 pre-mRNA target과 effector domain을 특이 적으로 결합시키는 RNA 인식 모듈을 포함하여 모듈 형 배열을 갖는 RNA Binding Protein (RBP)에 의해 매개된다. 이전에 우리는 인간 Pumilio 1의 PUF 도메인의 고유 한 RNA 결합 모드를 이용하여 RNA 신진 대사를 조작하기 위해 다양한 인공 RBP를 설계하는 프로그래밍 가능한 RNA 바인딩 스캐 폴드를 생성했습니다. 여기에는 세부적인 프로토콜이 구체적으로 표적 유전자의 선택적인 접합을 조절하도록 설계된 공학적 접합 인자 (ESF)를 구축하기 위해 기술되어있다. 이 프로토콜에는 특정 RNA 표적을위한 맞춤화 된 PUF 스캐 폴드를 설계하고 구성하는 방법, 디자이너 PUF 도메인과 이펙터 도메인을 융합시켜 ESF 발현 플라스미드를 구축하는 방법 및 ESF를 사용하여 표적 유전자의 접합을 조작하는 방법이 포함됩니다. 이 방법의 대표 결과에서, 우리는 또한 일반적인 assays를 설명했다스 플라이 싱 리포터를 사용한 ESF 활동, 배양 된 인간 세포에서의 ESF의 적용 및 스 플라이 싱 변화의 후속 효과. 이 보고서의 상세한 프로토콜을 따르면, 다른 유형의 Alternative Splicing (AS)의 조절을위한 ESF를 설계하고 생성 할 수 있으며, 접합 조절 및 다른 접합 이형의 기능을 연구하기위한 새로운 전략을 제공합니다. 또한, 설계된 PUF 영역과 다른 기능 영역을 융합시킴으로써 연구원은 RNA 공정의 다양한 단계를 조작하기 위해 특정 RNA를 표적으로하는 인공 인자를 설계 할 수있다.
Introduction
대부분의 인간 유전자는 스 플라이 싱 (AS)가 크게 게놈 (1, 2)의 부호화 복잡도를 증가 구별 활동 여러 이성체를 제조 겪는다. AS는 유전자의 기능을 조절하는 주요 메커니즘을 제공하며, 밀접 다른 셀룰러 및 발달 단계 3, 4에서 다양한 경로를 통해 조절된다. 접합 misregulation 인간의 질병 5, 6, 7, 8의 일반적인 원인이기 때문에, 접합 규제를 대상으로하는 것은 매력적인 치료 경로가되고있다.
주로 접합 촉진제 또는 대체 엑손 소음기로서 기능 mRNA의 사전에 규정 -Elements 시스 접합 (SRES)에 의해 제어되는 바와 같이, 스플 라이스 규제의 간략화 모델에 따라. 목SREs는 스 플라이 싱 반응을 촉진 또는 억제하는 다양한 트랜스 – 작용 단백질 인자 ( 즉, 스 플라이 싱 인자)를 구체적으로 모집한다 3 , 9 . 대부분의 trans- acting splicing factor는 splicing을 제어하기 위해 타겟과 이펙터 도메인을 인식하기 위해 별도의 서열 특이 적 RNA 결합 도메인을 가지고 있습니다. 가장 잘 알려진 예는 exon splicing enhancer를 결합하는 N- 말단 RNA 인식 모티프 (RRMs) 및 엑손 삽입을 촉진시키는 C- 말단 RS 도메인을 포함하는 세린 / 아르기닌이 풍부한 (SR) 단백질 군의 구성원이다 . 반대로, hnRNP A1은 RRM 도메인을 통해 엑소닉 스 플라이 싱 사일런서에 결합하고 C- 말단 글리신이 풍부한 도메인을 통해 엑손 삽입을 억제한다. 이러한 모듈 형 구성을 사용하여 연구자는 서로 다른 효과를 갖는 특정 RNA 결합 도메인 (RBD)을 결합함으로써 인공적인 접합 인자를 조작 할 수 있어야한다활성화 도메인을 TOR 또는 접합을 억제.
이러한 설계의 핵심은 동화 영역의 DNA 결합 모드 유사 프로그램 RNA 결합 특이성과 함께 대상을 인식하는 소정의 RBD를 사용하는 것이다. 그러나, 대부분의 천연 스플 라이스 인자는 RRM을 포함하거나 이와 친 화성이 약하고 짧은 RNA 요소를 인식하고 K 동성 (KH) 도메인, 예측 RNA 단백질 인식 "코드"(12)이 부족하다. PUF 반복 단백질의 RBD는 (즉, PUF 도메인) (14), 특히 다른 RNA를 인식하는 PUF 도메인의 재 설계를 허용, 독특한 RNA 인식 모드가 13 목표로하고있다. 정규 PUF 도메인은 각각 8 NT의 RNA 표적의 단일 염기를 인식하는 세 개의 α 나선 여덟 반복을 포함한다. t의 왓슨 – 크릭 가장자리 번째 α 나선 형태 특정 수소 결합의 특정 위치에서 아미노산의 측쇄그는 각각의 반복 ( 그림 1A )의 RNA 바인딩 특이성을 결정 RNA베이스. PUF 반복의 RNA 염기 인식을위한 코드는 놀라 울 정도로 간단하며 ( Figure 1A ), 가능한 8 염기 조합을 인식하는 PUF 도메인을 생성 할 수 있습니다 (Wei and Wang 15 ).
이 모듈 형 설계 원리는 맞춤화 된 PUF 도메인과 접합 변조 도메인 ( 예 : SR 도메인 또는 Gly- 풍부한 도메인)으로 구성된 공학적 접합 요소 (ESF)를 생성 할 수있게합니다. 이 ESFs는 스 플라이 싱 액티베이터 (splicing activator) 또는 다양한 유형의 스 플라이 싱 이벤트를 제어하기위한 억제제로서 기능 할 수 있으며, 인간 질병과 관련된 내인성 유전자의 스 플라이 싱을 조작하는 도구로서 유용하다. 예를 들어, Bcl-x 유전자의 스 플라이 싱을 구체적으로 변경하기 위해 PUF-Gly- 유형 ESF를 구축했다(Bcl-xL)을 프로 – 아폽토시스 (pro-apoptotic) 단 이소성 형태 (Bcl-xS)로 전환시키는 것을 특징으로하는 방법. Bcl-x isoform의 비율을 바꾸는 것은 여러 가지 암 세포를 여러 항암 화학 요법 약물에 민감하게 만들기에 충분했으며, 이러한 인공 인자가 잠재적 인 치료 시약으로 유용 할 수 있음을 시사한다.
공지 된 스 플라이 싱 이펙터 도메인 ( 예 : RS 또는 Gly- 리치 도메인)으로 스 플라이 싱을 제어하는 것 외에도, 설계된 PUF 인자를 사용하여 새로운 스 플라이 싱 인자의 활성을 조사 할 수있다. 예를 들어,이 접근법을 사용하여 여러 SR 단백질의 C 말단 도메인이 다른 pre-mRNA 영역 18에 결합 할 때 접합을 활성화하거나 억제 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. RBM4의 알라닌이 풍부한 주제는 접합 19 를 억제 할 수 있고, DAZAP1의 프롤린이 풍부한 모티프는 스 플라이 싱을 향상시킬 수있다 20 , 21 </ sup>. 이러한 새로운 기능 영역은 추가적인 유형의 인위적 요인을 구성하여 접합을 미세 조정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서는 구체적으로 표적 유전자의 대체 스 플라이 싱을 조작 할 수있는 인공 접합 요소의 설계 및 구성에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이 방법은 사용자의 특이성을 갖는 RNA 결합 골격을 생성하기 위해 반복 PUF의 고유 모드 RNA 결합을 이용한다. 그것은 중 하나를 활성화하거나 접합을 억제하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 핵심 단계는 ESFs의 특이성을 정의 r…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R01-CA158283 및 NSFC에 의해 ZWYW에 31,400,726는 젊은 천 인재 프로그램 및 국립 자연 과학 중국의 재단 (보조금 31471235 및 81422038)에 의해 자금 지원 허용 지원되었다. XY 중국의 박사후 과학 재단 (2015M571612)에 의해 지원된다.
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
Referencias
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