تحليل Metagenomic من السيلاج
Summary
Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Abstract
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Introduction
Metagenomics هو تحليل مباشر من الحمض النووي تنقيته من المجتمعات البيولوجية الموجودة في العينات البيئية 1، وكان يستخدم في الأصل للكشف عن البكتيريا unculturable الموجودة في الرواسب 2. وقد استخدم على نطاق واسع Metagenomics لعدد من التطبيقات، مثل تحديد microbiome الإنسان 3، تصنيف السكان الميكروبية داخل المحيط 4 وحتى لتحليل المجتمعات البكتيرية التي تضع على آلات القهوة 5. أدى إدخال تقنيات التسلسل الجيل القادم في أكبر الإنتاجية تسلسل والإخراج. ونتيجة لذلك، أصبح تسلسل الحمض النووي أكثر اقتصادا 6 وعمق تسلسل التي يمكن القيام بها قد زاد بشكل كبير، مما metagenomics لتصبح قوية وأداة تحليلية.
دفعت التعزيزات "الواجهة الأمامية" في الجانب العملي، الجزيئي للتسلسل metagenomic نمو فيأدوات سيليكون والمعلوماتية الحيوية المتاحة لتصنيف التصنيفية 7-9، والشرح وظيفية 10،11 و 12،13 التمثيل المرئي للبيانات تسلسل الحمض النووي. تزايد عدد المتاحة، التسلسل أولية النواة وحقيقية النواة 14 الجينوم يسمح مزيد من الدقة في تصنيف المجتمعات الميكروبية، التي تتم دائما ضد "في نهاية العام" قاعدة بيانات مرجعية من الجينوم متسلسلة 15. ويمكن اعتماد نهجين رئيسيين لتحليل metagenomic.
طريقة أكثر تقليدية هو تحليل الجينات 16S الريباسي الترميز المنطقة من جينوم بكتيري. يتم حفظها في 16S الريباسي للغاية بين الأنواع بدائيات النوى ولكن المعارض تسع مناطق فرط متغير (V1 – V9) التي يمكن استغلالها لتحديد الأنواع 16. إدخال التسلسل الطويل (≤ 300 نقطة أساس نهاية الاقتران) يسمح لتحليل تسلسل الحمض النووي التي تغطي منطقتين شديدة متغير، ولا سيماوV3 – المنطقة V4 17. التقدم في تقنيات التسلسل الأخرى، مثل أكسفورد ثقب النانو 18 و 19 PacBIO، لا يسمح كامل الجينات 16S الريباسي لتكون متسلسلة متاخم.
بينما توفر 16S الحمض النووي المؤتلف المكتبات القائمة على نهج تستهدف تحديد الأنواع وتمكن من الكشف عن عدد المنخفضة نسخة الحمض النووي الذي يحدث طبيعيا في عينات النقاء والمكتبات بندقية التسلسل تسمح للكشف عن الأنواع التي قد تحتوي على مناطق الحمض النووي التي هي إما غير amplifiable من قبل 16S الريباسي تسلسل علامة التمهيدي المستخدمة، أو بسبب الخلافات بين تسلسل قالب وتسلسل تضخيم التمهيدي كبيرة جدا 20،21. وعلاوة على ذلك، على الرغم من بلمرة الحمض النووي لديها الدقة العالية تكرار الحمض النووي، وأخطاء قاعدة يمكن مع ذلك أن يحدث خلال PCR والتضخيم، وهذه الأخطاء أدرجت يمكن أن يؤدي إلى تصنيف غير صحيحة من مصدرها الأنواع 22. التحيز في التضخيم PCR من بعدها القالبيمكن أيضا أن تحدث uences. تسلسل الحمض النووي مع محتوى GC عالية يمكن أن يكون تحت الممثلة في تجمع amplicon النهائي 23 وبالمثل التعديلات قاعدة غير طبيعية، مثل غليكول الثايمين، يمكن وقف بلمرة الحمض النووي تسبب الفشل في التضخيم من الحمض النووي تسلسل 24. في المقابل، مكتبة الحمض النووي بندقية التسلسل هي مكتبة الحمض النووي التي تم إعدادها باستخدام كل من الحمض النووي المنقى الذي تم استخراجه من عينة ومجزأة في وقت لاحق إلى أطوال سلسلة أقصر الحمض النووي قبل التحضير لالتسلسل. وأكثر دقة مقارنة تصنيف التصنيفي للتسلسل الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل طلقات نارية على 16S الريباسي amplicon التسلسل 25، على الرغم من أن التكلفة المالية المطلوبة للوصول إلى عمق التسلسل موثوق هو أعظم من ذلك من amplicon تسلسل 26. الفائدة الرئيسية من metagenomics بندقية التسلسل هو أن المناطق متسلسلة من مختلف العوامل الوراثية في العينة متاحة للتنقيب الجينات مرة واحدة أنها كانتتم تصنيف تصنيفيا 27.
ويتم تحليل Metagenomic تسلسل البيانات من قبل مجموعة متزايدة من أدوات بيوينفورمتيك. هذه الأدوات هي قادرة على أداء مجموعة واسعة من التطبيقات، على سبيل المثال، تحليل ومراقبة جودة البيانات تسلسل الخام 28، وتداخل في نهاية يقترن يقرأ 29، دي نوفو تجميع تسلسل يقرأ لcontigs والسقالات 30،31، تصنيف التصنيف والتصور تسلسل يقرأ وتجميع سلاسل 7،12،32،33 والشرح وظيفية من متواليات تجميعها 34،35.
السيلاج، التى ينتجها المزارعون في جميع أنحاء العالم من الحبوب المخمرة مثل الذرة (ذرة شامية)، ويستخدم في الغالب كعلف للماشية. يتم التعامل مع السيلاج مع س البكتيريا الملبنة. لمساعدة التخمير 36 ولكن حتى الآن، هناك معرفة محدودة السكان الميكروبية أخرى وجدت في السيلاج. على انزيمعملية ن يمكن أن يؤدي إلى الكائنات الدقيقة غير مرغوب فيها ويمكن أن تكون ضارة تصبح سائدة داخل السيلاج 37. بالإضافة إلى الخمائر والفطريات والبكتيريا قابلة للتكيف بشكل خاص على البيئة اللاهوائية في تخمير الأعلاف وأكثر في كثير من الأحيان ترتبط مع الأمراض في الماشية بدلا من تدهور السيلاج 38. بكتيريا حمض زبدي يمكن أن تضاف عن غير قصد من التربة لا تزال عند ملء الصوامع السيلاج وتكون قادرة على تحويل حمض اللبنيك، وهو منتج من الهضم اللاهوائي، لحامض زبدي، وبالتالي زيادة درجة الحموضة في السيلاج 39. هذه الزيادة في درجة الحموضة يمكن أن يؤدي إلى زيادة في البكتيريا التلف التي عادة ما تكون غير قادرة على مواصلة النمو في ظل السيلاج الأمثل ظروف التخمر 38. كلوستريديوم النيابة. ، الليسترية. وعصية النيابة. تثير القلق بشكل خاص، لا سيما في السيلاج كعلف للماشية الألبان، والجراثيم البكتيرية التي نجت من الاضالجهاز ointestinal 40 يمكن أن تدخل في السلسلة الغذائية، يؤدي إلى تلف المواد الغذائية و، في حالات نادرة، إلى الحيوان وفيات بشرية 37،39،41-44. وعلاوة على ذلك، في حين أنه من الصعب تقدير التأثير الاقتصادي المحدد من العلاج البيطري وفقدان الماشية الناجمة عن تلف السيلاج، فمن المحتمل أن تكون ضارة إلى مزرعة إذا كان تفشي تحدث.
والافتراض بأن باستخدام نهج metagenomic يمكننا تصنيف السكان الميكروبية الموجودة في عينات الأعلاف وعلاوة على ذلك تحديد المجتمعات الميكروبية المرتبطة تلف السيلاج من شأنه، في المقابل، من المحتمل أن يكون لها تأثير ضار على الماشية، مما يتيح إجراءات تصحيحية ليكون اتخذت قبل السيلاج لاستخدامه كمصدر للغذاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن في تحليل SILICO يمكن أن تعطي فكرة ممتازة إلى المجتمعات الميكروبية التي تكون موجودة ضمن العينات البيئية، فمن الأهمية بمكان أن التصنيفات التصنيفية أظهرت أن يقوم بالتعاون مع الضوابط ذات الصلة والتي تم التوصل إلى عمق مناسب من تسلسل للقبض على كامل السكان الحالي 51.
مع أي تحليل الحسابية، وهناك العديد من الطرق لتحقيق هدف مماثل. الأساليب التي استخدمناها في هذه الدراسة هي أمثلة على أساليب مناسبة وواضحة، والتي تم عرضها معا لتحقيق مجموعة من التحليلات على microbiome السيلاج. وهناك مجموعة متنوعة وعدد متزايد من الأدوات والتقنيات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحليل البيانات metagenomic، على سبيل المثال Phylosift 8 و MetaPhlAn2 52، وهذه يجب أن يتم تقييم مسبق للتحقيق لأهميتها بالنسبة للعينة ومسا تحليلuired 53. تقتصر أساليب التحليل Metagenomic من قواعد البيانات الخاصة متاحة للتصنيف، وعمق التسلسل ونوعية التسلسل.
تم إجراء معالجة بيوينفورمتيك تظاهر هنا على، آلة تعمل بالطاقة العالية المحلية؛ ومع ذلك النظم القائمة على السحابة وتتوفر أيضا. هذه الخدمات المستندة إلى سحابة تسمح لاستئجار الطاقة الحسابية اللازمة دون الحاجة للاستثمار عالية التكلفة لمحطة العمل المحلية قوية مناسبة. ومن شأن التطبيق المحتمل لهذه الطريقة هو تقييم السيلاج قبل استخدامه في الزراعة لضمان عدم وجود البكتيريا الضارة المحتملة موجودة وبالتالي منعهم من دخول السلسلة الغذائية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
Materials
| FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
| DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
| Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
| Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
| TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
| HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
| HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
| TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
| TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
| HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
| High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |
Referencias
- Riesenfeld, C. S., Schloss, P. D., Handelsman, J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities. Annu. Rev. Genet. 38 (1), 525-552 (2004).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59 (1), 143-169 (1995).
- Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Venter, J. C., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science. 304 (5667), 66-74 (2004).
- Vilanova, C., Iglesias, A., Porcar, M. The coffee-machine bacteriome: biodiversity and colonisation of the wasted coffee tray leach. Sci. Rep. 5, 17163 (2015).
- Hayden, E. C. Technology: The $1,000 genome. Nature. 507 (7492), 294-295 (2014).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Gen. Biol. 15 (3), 46 (2014).
- Darling, A. E., et al. PhyloSift: phylogenetic analysis of genomes and metagenomes. PeerJ. 2 (12), 243 (2014).
- Buchfink, B., Xie, C., Huson, D. H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat. Meth. 12 (1), 59-60 (2015).
- Moreno-Hagelsieb, G., Hudy-Yuffa, B. Estimating overannotation across prokaryotic genomes using BLAST+, UBLAST, LAST and BLAT. BMC Res Notes. 7 (1), 651 (2014).
- Hauser, M., Steinegger, M., Söding, J. MMseqs software suite for fast and deep clustering and searching of large protein sequence sets. Bioinf. 32 (9), 1323-1330 (2016).
- Ondov, B. D., Bergman, N. H., Phillippy, A. M. Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC Bioinf. 12, (2011).
- Kolde, R., Vilo, J. GOsummaries: an R Package for Visual Functional Annotation of Experimental Data. F1000Res. 4, 574 (2015).
- Reddy, T. B. K., et al. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.5: a metadata management system based on a four level (meta)genome project classification. Nuc. Aci. Res. 43 (1), 1099-1106 (2015).
- Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421 (2009).
- Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J. Micro. Met. 69 (2), 330-339 (2007).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
- Mikheyev, A. S., Tin, M. M. Y. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1097-1102 (2014).
- Schadt, E. E., Turner, S., Kasarskis, A. A window into third generation sequencing. Hum. Mol. Genet. 20 (4), 853-853 (2011).
- Shapiro, B., Hofreiter, M. A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA. Science. 343 (6169), 1236573 (2014).
- Der Sarkissian, C., et al. Ancient genomics. Phil. Trans. R. Soc. B. 370 (1660), (2015).
- Patin, N. V., Kunin, V., Lidström, U., Ashby, M. N. Effects of OTU Clustering and PCR Artifacts on Microbial Diversity Estimates. Microb Ecol. 65 (3), 709-719 (2013).
- McInroy, G. R., Raiber, E. -. A., Balasubramanian, S. Chemical biology of genomic DNA: minimizing PCR bias. Chem. Commun. 50 (81), 12047-12049 (2014).
- Aller, P., Rould, M. A., Hogg, M., Wallace, S. S., Doublié, S. A structural rationale for stalling of a replicative DNA polymerase at the most common oxidative thymine lesion, thymine glycol. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 814-818 (2007).
- Ranjan, R., Rani, A., Metwally, A., McGee, H. S., Perkins, D. L. Analysis of the microbiome: Advantages of whole genome shotgun versus 16S amplicon sequencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 469 (4), 967-977 (2016).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Li, X., Rao, S., Wang, Y., Gong, B. Gene mining: a novel and powerful ensemble decision approach to hunting for disease genes using microarray expression profiling. Nuc. Aci. Res. 32 (9), 2685-2694 (2004).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinf. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 19 (5), 455-477 (2012).
- Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. . metaSPAdes: a new versatile de novo metagenomics assembler. , (2016).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Tanaseichuk, O., Borneman, J., Jiang, T. Phylogeny-based classification of microbial communities. Bioinf. 30 (4), 449-456 (2014).
- Bose, T., Haque, M. M., Reddy, C., Mande, S. S. COGNIZER: A Framework for Functional Annotation of Metagenomic Datasets. PLoS ONE. 10 (11), 0142102 (2015).
- Sharma, A. K., Gupta, A., Kumar, S., Dhakan, D. B., Sharma, V. K. Woods: A fast and accurate functional annotator and classifier of genomic and metagenomic sequences. Genomics. 106 (1), 1-6 (2015).
- Eikmeyer, F. G., et al. Metagenome analyses reveal the influence of the inoculant Lactobacillus buchneri CD034 on the microbial community involved in grass ensiling. J. Biotech. 167 (3), 334-343 (2013).
- Driehuis, F., Elferink, S. J. W. H. O. The impact of the quality of silage on animal health and food safety: A review. Vet. Quart. 22 (4), 212-216 (2000).
- Dunière, L., Sindou, J., Chaucheyras-Durand, F., Chevallier, I., Thévenot-Sergentet, D. Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganisms. Anim Feed Sci Technol. 182 (1-4), 1-15 (2013).
- Vissers, M. M. M., et al. Minimizing the Level of Butyric Acid Bacteria Spores in Farm Tank Milk. J. of Dairy Sci. 90 (7), 3278-3285 (2007).
- Te Giffel, M. C., Wagendorp, A., Herrewegh, A. Bacterial spores in silage and raw milk. Antonie van. , (2002).
- Wiedmann, M. ADSA Foundation Scholar Award-An Integrated Science-Based Approach to Dairy Food Safety: Listeria monocytogenes as a Model System. J. of Dairy Sci. 86 (6), 1865-1875 (2003).
- Low, J. C., Donachie, W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet J. 153 (1), 9-29 (1997).
- Schoder, D., Melzner, D., Schmalwieser, A. Important vectors for Listeria monocytogenes transmission at farm dairies manufacturing fresh sheep and goat cheese from raw. J.Food. , (2011).
- Lindström, M., Myllykoski, J., Sivelä, S., Korkeala, H. Clostridium botulinumin Cattle and Dairy Products. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50 (4), 281-304 (2010).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456 (7218), 53-59 (2008).
- Andrews, S. . Babraham Bioinformatic- FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. , (2015).
- Keegan, K. P., Glass, E. M., Meyer, F. FMG-RAST, a Metagenomics Service for Analysis of Microbial Community Structure and Function. Methods Mol. Biol. 1399, 207-233 (2016).
- Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nuc. Aci. Res. 37, 233-238 (2009).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinf. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Heberle, H., et al. InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinf. 16 (1), 213 (2015).
- Ni, J., Yan, Q., Yu, Y. How much metagenomic sequencing is enough to achieve a given goal. Sci. Rep. 3, 1968 (2013).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nat. Meth. 12 (10), 902-903 (2015).
- Oulas, A., et al. Metagenomics: tools and insights for analyzing next-generation sequencing data derived from biodiversity studies. Bioinform Biol Insights. 9 (9), 75-88 (2015).
