목초의 군 유전체학 분석

1. 사이트 위치 이러한 농장 같은 적절한 사이트에서 사일리지 시료를 수집합니다. 여기서, 농장은 Ballydulea, (주) 코크, 아일랜드 (51 ° 51'58.4 "N 8 ° 16'48.7"W)에 위치했다. 2. DNA 추출 참고 : DNA 추출은 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 수행 하였다. 어떠한 시료를 함유하지 않는 음성 대조군은 라이브러리 제조 방법에서 사용 하였다. 공급 된 용해 튜브에 978 μL의 인산 나트륨 완충액 122 μL 토양 용해 완충액으로 샘플을 400 mg의 – (100)를 추가한다. 6.0 m / s의 속도로 40 초 동안 균질화에 용해 튜브를 배치하여 샘플 균질화. 원심 분리기 해물을 15 분 동안 14,000 XG에와 단백질 침전물 솔루션의 250 μL (PPS)를 포함하는 깨끗한 마이크로 원심 분리 관에 뜨는을 전송합니다. 10 회 원심 분리를 반전시켜 용액을 섞어5 분 동안 14,000 XG에. 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 1 mL의 DNA 결합 행렬에 뜨는을 추가합니다. 3 분 동안 계속해서, 튜브를 뒤집어 용액을 혼합한다. 혼합물 후, 3 분 동안 정착 상층 액 500 μL를 취소 할 수 있습니다. 나머지 뜨는을 섞는다. 1 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 현탁액 600 μL를 전송합니다. 여과 액을 취소하고 나머지 서스펜션 과정을 반복합니다. 다음 1 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기, 피펫 팅하여 혼합, 스핀 필터 내에서 DNA 결합 행렬에 세척 완충액 500 μL를 추가합니다. 여과 액을 취소하고 2 분 모든 세척 버퍼가 제거되었는지 확인하는 14,000 XG에 다시 스핀 필터를 원심 분리기. 5 분 동안 23 ℃에서 스핀 필터를 건조. 사전 따뜻한 (70 ℃)에 DNase의없는 물 (DES) 및 다시 중단 스핀 필터 내에서 DES의 100 μL의 DNA 결합 행렬. 깨끗한 1.5 ML의 마이크로 원심 분리기 TU에 스핀 필터로 이동하고 1 분은 DNA를 용출하는 14,000 XG에 원심 분리기. 추가 분석을 수행 할 때까지 -20 ℃에서 정제 된 DNA를 저장합니다. 3. DNA 정제하여 DNA 정제 비즈 주 : DNA 추출 순수한 DNA 샘플을 위해 정제 비드를 사용하여 정제 전 군 유전체학 라이브러리에 준비 얻었다. 사용하기 전에 30 분 동안 23 ℃에서 구슬을 품어. DNA의 샘플에 구슬이 볼륨을 추가하고 5 분 동안 23 ℃에서 솔루션을 품어. 5 분 동안 분리 자석에 샘플을 배치 한 후 상층 액을 버린다. 200 μL 신선한 80 % 에탄올 (EtOH를) 두 번 구슬을 씻으십시오. 공기를 10 분 동안 비드를 건조. 분리 자석에서 샘플을 제거하고 용출 버퍼 (EB)의 50 μL를 추가, 피펫 팅하여 혼합한다. 그 후 다시 3 분의 분리 자석 위에 샘플을 놓고 5 분 동안 23 ℃에서 서스펜션을 품어. TR깨끗한 튜브에 DNA를 포함하는 상층 액을, ansfer. 구슬을 폐기하십시오. 섹션 4에 따라 정제 된 DNA를 정량화. 정제 된 DNA의 4 정량 참고 : 정제 된 DNA에 형광 분석기 제조업체의 지침에 따라 이중 가닥 (dsDNA) 고감도 (HS) 분석 키트를 사용하여 정량 하였다. 시약하기 위해 버퍼 : 1 비율 199를 사용하여 작업 솔루션을 준비합니다. 작업 용액 190 μL 각 DNA 표준의 10 μL를 추가합니다. 솔루션을 작업의 190 μL에 정제 된 DNA의 10 μL를 추가합니다. 최종 부피는 200 μL해야합니다. 2 분 동안 23 ℃에서 표준 및 DNA 샘플을 품어. 화면의 지시를 사용하여 형광 분석기의 DNA 샘플 전에 표준을 분석합니다. 5. 샷건 시퀀싱 라이브러리 준비 참고 : 샷건 시퀀싱 라이브러리가를 사용하여 제조 하였다제조업체의 지침을 사용하여 상용 라이브러리 준비 키트. 0.2 NG / μL 사용 EB에 DNA 샘플을 희석. 이 농도 이하 이미 상관 샘플을 음성 대조군, 즉, 현재의 농도로 남겨진다. 버퍼, 5 μL 효소 믹스 10 μL로 정제 된 DNA의 5 μL를 섞는다. 5 분 동안 55 ℃에서 샘플을 품어. 버퍼를 중화의 5 μL를 추가하고 5 분 동안 23 ℃에서 솔루션을 품어. 샘플 특정 순서 인덱스의 각 5 μL, 15 μL PCR의 마스터 믹스를 추가합니다. 열 순환기에서, 10 초, 30 초 55 C와 30 초 72 ˚C 95 ˚C의 12주기 전에 3 분 30 초 95 ˚C 72 ℃에서 샘플을 품어. 5 분 동안 72 ℃에서 마지막으로 샘플을 품어. 전과하지만 EB 30 μL의 최종 용출 비드 정제를 사용하여 제조 된 DNA를 정제 하였다. 6. Library 수량 및 품질 검사 참고 : 준비 라이브러리의 양과 질은 상용 키트와 장비를 사용하여 평가 하였다. 사용하기 전에 30 분 동안 23 ℃에서 상기 키트 부품 인큐베이션. 2,000 rpm에서 1 분간 버퍼와 소용돌이의 2 μL로 DNA의 2 μL를 추가합니다. 이 튜브의 아래쪽에 있도록 시료를 스핀. 악기에 샘플 튜브, 분석 테이프 및 팁을 삽입하고 소프트웨어의 지시에 따라 분석을 수행합니다. 7. DNA 시퀀싱 300 bp의 페어링 단부 서열 45를 사용하여 시퀀싱 서비스 서열 제조 정량 DNA 서열 라이브러리 샘플을 옮긴다. 원시 시퀀스 데이터의 8 분석 주 : 리눅스 운영 체제를 사용하여 각 프로그램의 명령 프로토콜 단계를 이하에 나타낸다. S에 사용되는 파이프 라인equence 데이터 분석은도 1에 도시되어있다. 프로그램은 분석하기 전에 사용자가 설치되어야한다. 이 프로세스는 각각의 샘플에 대해 개별적으로 수행되어야한다. 분석하고 앞으로 다음, 명령 줄 / 경로에 파일 / fastqc에 입력하여 FastQC (46)를 이용하여 DNA 시퀀스 데이터를 시각화하고 원료가 raw_read1.fastq raw_read2.fastq를 읽고 역. -o output_fastqc 및 -f fastq하여 원시 읽기 파일의 파일 형식을 입력하여 출력 폴더를 지정합니다. 출력 파일 (그림 2) 볼 수 있습니다. 경로에 파일 / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o OUTPUT_DIRECTORY -f fastq. 9. 품질 관리 트리밍 및 필터링 시퀀스 데이터 명령 행 자바 -jar / 경로에 파일 / trimmomatic-0.35.jar에 입력하여 트리밍 프로그램, Trimmomatic (28)를 실행합니다. 지정 파일은 'PE'를 입력하여 최종 파일을 쌍으로. 국가가 16 중앙 홍보ocessing 장치 (CPU는) -threads (16)을 입력하여 프로그램에 의해 사용되어야한다. 원시 앞으로의 이름을 입력하여 QC 검사에 두 개의 파일을 나열하고 읽고 역. 출력 파일의 접두사는 -baseout 사일리지를 입력하여 결정된다. ILLUMINACLIP을 입력하여 프로그램에 대한 옵션을 정의합니다 NexteraPE-PE.fa : 2 : 30 : 10 선도적 : 3 TRAILING : 3 SLIDINGWINDOW : 4 : 20 CROP : 200 HEADCROP : 15 minlen이 36. 완료되면, 이전과 FastQC를 사용하여 트리밍 된 서열을 분석하고 성공적으로 수행 된 트리밍되도록하여 로우 시퀀스 데이터의 출력을 비교한다. 참고 : 소프트웨어 도구, Trimmomatic이, 최고의 품질이 낮은 또는 N 기지 제거하여 더 읽어 트림 (아래를 품질 3), 품질이 낮은 또는 N 기지 후행 제거 (아래를 품질 3) 각 4베이스 넓은 슬라이딩 윈도우 읽을 검색. 매개 변수는 기본 당 평균 품질이 어느 36 기지 긴 아래 읽어 드롭 후 20 이하로 떨어질 때 절단 설정했다. 마지막으로, 15 기지는 FR 자른했다OM 각각의 헤드는 판독 및 판독 개시로부터 200 염기를 유지 하였다 자른 읽는다. 마지막 단계는 긴 시퀀싱 할 때 일부 품질 문제를 극복하기 위해 수행되었다 (> 200 BP)를 읽습니다. 이러한 특정 샘플 (28)에 대해 조정될 수있다. 자바 -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout 사일리지 ILLUMINACLIP : NexteraPE-PE.fa : 2 : 30 : 10 선도적 : 3 TRAILING : 3 SLIDINGWINDOW : 4 : 20 CROP : 200 HEADCROP : 15 minlen이 : 36 10 Metagenome 조립 의 짝이 트리밍 병합하면 짝이 읽기 다음에 고양이를 입력하여 읽 silage_read2_unpaired.fastq silage_read1_unpaired.fastq. 입력하여 새 파일에 파일 쓰기> silage_merged_unpaired.fastq 고양이 silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq> silage_merged_unpaired.fastq 드 노보는 염기 서열 DNA를 조립, 입력 / 경로에 의해 스페이드 (상트 페테르부르크 게놈 어셈블러) 30 사용- 파일 / spades.py. 16 CPU가 –meta 입력하여 적용해야하는 군 유전체학 매개 변수 (16) -t 입력하여 것을 사용되도록 지정합니다. 앞으로 손질 확인하면 사용 -1 silage_read1_paired.fastq을 읽고 반대 -2 silage_read2_paired.fastq으로 읽습니다. 병합 된 부대는 -s silage_merged_unpaired.fastq에 의해 지정됩니다 읽습니다. silage_spades을 -o 입력하여 출력 폴더를 정의합니다. 경로에 파일 / spades.py은 -t 16 –meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades 11. 짝 엔드 읽기 오버랩 DNA 서열의 쌍 명령 줄 / 경로에 파일 / 플래시에 입력하여 FLASH (Short의 빠른 길이 조정 읽습니다) (29)를 사용하여 읽기 병합합니다. 16 CPU가 사일리지를 -o 입력하여 (16)와 출력 접두사를 -t 사용하여 사용해야 함을 지정합니다. 손질 확인 silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq을 입력하여 읽고 경로에 파일 / 플래시 1 -t6 -o는 silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq을 번쩍 (12) 분류 학적 분류 종류 / 경로-에 파일 / 크라켄 및 / 경로에 파일 / 표준을 –db 입력하여 데이터베이스를 지정합니다. 16 개의 CPU가 –threads (16)을 입력하여 사용하는 것을 정의하고 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt을 –output 사용하여 출력 폴더를 식별합니다. 입력 파일 이름을 입력하고, FLASHed_silage.extendedFrags.fastq 경로에 파일 / 크라켄 –db 표준 –thread 16 –output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq 주 : 크라켄 7하여 조립 된 DNA 서열 비계의 분류가 가능한 모든 원핵 생물 (Prokaryote)의 게놈 서열을 함유 최신 표준 크라켄 데이터베이스에 대해 완료되었다. -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int 컷을 입력하여 출력 파일에서 새 파일로 전송 컬럼 2, 3 <li> 웹 브라우저에서 출력 파일을 엽니 다. -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int 컷 ktImportTaxonomy을 입력하여 크로나 (12)에 새 파일을 가져옵니다. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int을 입력하여 입력 파일을 지정합니다. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html을 -o 입력하여 출력 파일을 확인합니다. 경로에 파일 / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html 13. 기능 주석 MG-RAST 47 웹 사이트, http://metagenomics.anl.gov/로 이동합니다. 필요한 경우 새 사용자로 등록합니다. 로그인 후, "업로드"버튼을 클릭합니다. 10 단계에서 조립 된 비계를 업로드합니다. 파일을 업로드 한 후, "제출"하고 지시 사항을 따르 클릭하고 분석의 완료를 기다리고 있습니다. 분석이 완료되면, EM을 통해 전송 된 링크를 볼MG-RAST에서, 또는 대안 AIL, "진행"을 클릭합니다. 완료된 작업의 목록이 있습니다. 관련 작업 ID에 다음 "다운로드 페이지"링크를 클릭합니다. 다운로드 페이지에서 제목 "단백질 클러스터링 90 %"에서, 550.cluster.aa90.faa을 예측 단백질 파일을 다운로드 단백질 버튼을 클릭합니다. 같은 추정되는 특정 CAZy 효소 클래스에 속하는 단백질을 분류하기 위해 CAZy 데이터베이스 (48)에 다운로드 된 단백질을 비교한다. 파일에서 탄수화물 – 활성 효소 데이터베이스 (CAZy)를 다운로드는 다음과 같습니다 AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip 및 PL.zip. 이러한 파일은 각각 다음과 효소 클래스를 나타냅니다 보조 활동 (AA), 탄수화물 에스 테라 제 (CE), 글리코 사이드 가수 분해 효소 (GH), 글리코 트랜스퍼 (GT)과 다당류 리아제 (PL)를. 데이터베이스 파일의 압축을 풀고 USEARCH UBLAST의 ALGOR를 사용 CAZy 데이터베이스 단백질 단백질 유사성을 결정함으로써 단백질 주석ithm 49. 5 데이터베이스가 .txt 파일 유형을 반복하는 (*이 .txt에서 난 용) 떠들썩한 파티 루프를 사용하려면 "*이 .txt에서 난 용, 할". ublast 알고리즘을 사용하기 위해 매개 변수 -ublast와 입력 / 경로에 파일을 / usearch8에 의해 USEARCH를 실행합니다. 이어서 MG-RAST "mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa"다운로드 단백질 시퀀스 파일의 이름을 입력. 데이터베이스 파일을 나타 내기 위해 "$ i가 -db"및 1E -5에서 E-값 임계 값을 지정하는 유형, 유형 "-evalue 1E-5"를 사용합니다. 표적 서열의 발견 이후 검색을 종료하고, 따라서 표적 효소 클래스 GH 예, 유형 "1 -masaccepts"에 속하는 것으로 그 단백질 서열을 분류한다. 16 개의 CPU 유형을 사용 "16 -threads"및 ATAB 구분 된 텍스트 형식 "-blast6out"로 출력 파일의 형식을 지정해야 함을 정의합니다. 출력 파일 형식 "$의 i.ublast"를 확인합니다. t, bash는 루프를 종료하려면타 입 "; 완료" *이 .txt에 대한 전; 할 / 경로에 파일을 / 내가 -evalue usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ 1E-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out; 끝난 14 떠올리 CAZy 주석 떠들썩한 파티 루프를 사용하여 각 효소 클래스 단백질 ID 목록을 벤 다이어그램으로 CAZy 주석의 출력을 시각화 생성합니다. "*의 .ublast에서 난 용, 수행"을 입력합니다. 출력 파일에서 새 파일을 열 1을 전송하려면, 유형 "고양이 $ 전 | -f 1> $의 i.list를 잘라". 루프 입력을 종료합니다 "; 완료". 텍스트 편집기에서 .list 파일을 엽니 다. 상기 웹 사이트로 이동으로 5 세트의 수를 선택하고 별도의 상자에 각리스트 파일의 내용을 붙여. .SVG 파일로 생성 된 다이어그램을 다운로드합니다. 난 *의 .ublast에 대한; 고양이 $의 난을 | 잘라 -f 1> $ i.list; 끝난