ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
その構造と機能を研究するためにタンパク質に化学プローブを導入するために利用可能な多くの化学ツールは現在ありません。有用な方法は、遺伝的にバイオ直交官能基を有する非天然アミノ酸を導入することによって、タンパク質結合です。このレポートには、サイト固有の抗体結合のための詳細なプロトコルを記述しています。プロトコルは、アジド含有アミノ酸の遺伝的取り込み、および歪み促進アジド – アルキン付加環（SPAAC）によって結合反応のための実験の詳細が含まれています。この株促進反応は、生理的pHおよび温度で反応する分子を単純に混合することによって進行し、例えば、銅（I）イオンと銅キレートリガンドなどの追加の試薬を必要としません。したがって、この方法は、一般的なタンパク質の結合および抗体薬物複合体（ADCの）の開発に有用であろう。
Introduction
大腸菌 におけるP -methoxyphenylalanineの遺伝的取り込みが報告されて以来、1、100以上の非天然アミノ酸（UAAs）が正常に様々なタンパク質に組み込まれています。 1-3これらのUAAsの中で、バイオ直交官能基を含むアミノ酸は、広く研究さと最大の割合を表してきました。 UAAsで使用されるバイオ直交官能基は、ケトン、4アジド、5アルキン、6シクロオクチン、7テトラジン、8α、β不飽和アミド、9ノルボルネン、10 transcyclooctene、11およびビシクロ[6.1.0] -nonyneが含まれます。各官能基は、その長所と短所を持っている11が、アジド含有アミノ酸は、最も広範にタンパク質結合に使用されてきました。 P -Azidophenylalanine（AF）、アジド含有アミノ酸の一つは、容易に入手可能であり、その取り込みefficiencyが優れています。このアミノ酸を含有する変異体タンパク質は、銅触媒による付加環化によって、またはSPAACによってcyclooctynesとアルキンと反応させることができます。 12月20日
最近、バイオ医薬品は、製薬業界で大きな注目を集めています。抗体-薬物複合体（ADC）が原因で、ヒトの癌21の治療のための標的治療のためのそれらの能力に有利である治療用抗体のクラスであり、 他の疾患。 50以上のADCは現在臨床試験中であり、その数は急速に増加しています。 ADCの開発では、多くの要因が有効性を最大化し、副作用を最小限にするために考慮される必要があります。これらの要因の中でも、抗体と薬物との間に共有結合を形成するための効率的かつ部位特異的コンジュゲーション反応は重要です。コンジュゲーション反応における所望の効率及び特異性にバイオ直交官能基と結合することによって達成することができます具体的に抗体に組み込まれる非天然アミノ酸。ここで22-26、我々は、部位特異的に組み込むためのプロトコルを報告します 抗体断片にAFとは、生化学的プローブと変異型抗体断片を結合します。
Protocol
1.プラスミド構築彼の6タグを有する標的抗体遺伝子（のpBAD-HerFab-WT）を発現し、アンバーコドン（TAG）とロイシン-177のコドンに代わる発現プラスミド（のpBAD-HerFab-L177TAG）を構築27、使用して従来の部位特異的変異誘発技術。 材料の表を参照してください。 進化したtRNA TyrおよびアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）ペアの遺伝…
Representative Results
本研究では、抗体断片は、部位特異的フラグメントにアジド含有アミノ酸を組み込んでいると歪みシクロオクチン（ 図1）を用いて変異体抗体断片を反応させることにより、フルオロフォアとコンジュゲートしました。 HerFabはAFがアジド含有アミノ酸として組み込んだ標的抗体フラグメントとして選択しました。 AFとの交換のためHerFab中の残留物を選…
Discussion
タンパク質への非天然アミノ酸の遺伝的組込みは、タンパク質修飾のために使用される他の方法に比べていくつかの利点を有しています。 1-3重要な利点の一つは、タンパク質の任意の種類への一般的な適用です。原理的には、標的タンパク質とタンパク質の標的部位を選択するには制限がありません。しかし、UAAと構造的または機能的に重要な残基の置換は、標的タンパク質の?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
Referencias
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Citar este artículo
Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).