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Medicina

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

Published: March 20, 2017
doi:
10.3791/54912
, , , , ,
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU),VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU),VU University Medical Center

Summary

인슐린 유도 혈관 근육 관류를 조절 하 고 증가 microvascular 표면적 (microvascular 모집) 용 질 exchange에 사용할 수 있는 혈액과 조직 interstitium 사이. 결합된 intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 동시에 큰 배와는 미세 혈관에서 인슐린의 활동을 평가 하 여 vivo에서.

Abstract

그것은 인슐린의 혈관 작업 인슐린 감도 기여할 증명 되었습니다. 근육 관류에 인슐린의 효과 조절 인슐린에 민감한 조직에 영양분과 호르몬의 식 후 배달 합니다. 우리는 여기 intravital 현미경 검사 법 (IVM) 및 대비 향상 된 초음파 (CEUS) 마우스 hindlimb 동시에 시각화 근육 저항 동맥의 내 전근 구획 및 관류의의 결합에 대 한 기술을 설명 합니다 미세 vivo에서. 동시에 혈관 트리의 여러 수준에서 인슐린의 효과 평가 하는 것은 인슐린의 여러 vasoactive 효과 근육 관류 사이 관계를 공부 하는 것이 중요. 이 연구에서는 실험 쥐에서 수행 했다. 첫째, 꼬리 정 맥 정 맥 마 취, vasoactive 화합물 및 초음파 대비 에이전트 (지질 캡슐화 microbubbles)의 주입에 삽입 됩니다. 둘째, 작은 절 개를 내 전근 근육 격실의 동맥 트리를 노출 하는 사 타 구니 지역에서 이루어집니다. 초음파 프로브 횡단면에서 근육을 보려면 contralateral 상단 hindlimb에 배치 됩니다. 동맥 직경 평가 기준 매개 변수를 평가 하 고 microbubbles 근육 혈액 흐름 및 microvascular 혈액 볼륨 (MBV) 추정을 일정 한 비율로 연속적으로 들어갈 수 있습니다. 적용 전과 hyperinsulinemic euglycemic 클램프 중, 결합 IVM 및 CEUS 간선 직경, microvascular 근육 관류 및 전신 인슐린 감도의 인슐린 유도 된 변화에 대 한 평가 허용 한다. 또한, 일시적인 관계는 미세 혈관의 반응 및 인슐린 저항 동맥 측정할 수 있습니다. 그것은 또한 후속 수 쥐 경도 시간, 혈관과 전신 인슐린 감도 있는 변화를 공부 하는 귀중 한 도구를 만드는.

Introduction

혈액 포도 당 수준에 있는 상승에 대응, 췌 어디 그것은 신속 하 게 저항 동맥과 모세 혈관을 통해 골격 근 등의 대상 조직에 배포 하는 혈 류로 인슐린을 은닉 한다. 골격 근육은 식 후 포도 당 통풍 관1~ 80%에 대 한 책임. 골격 근육 interstitium에 인슐린의 배달 될 단계 인슐린의 포도 당 처리2,,34홍보 대사 행동에 대 한 제한 속도를 보였다. 10-15 분 이내 인슐린 모 세관 혈액 볼륨 (microvascular 모집) 총 혈액 흐름 증가5,6하기 전에 발생 하는 효과 증가 시킵니다. Microvascular 모집 영양분 (과 인슐린)의 교환7,8에 사용할 수 있는 내 피 표면 영역을 확장합니다. Microvascular 모집 인슐린 중재 앞 이며 변화 골격 근육의 포도 당 통풍 관8,9에 독립적으로 연결 됩니다. 맥 관 구조에 인슐린의 효과 ‘혈관 인슐린 감도’ 되 나 되었습니다.

그것은 인슐린 중재 microvascular 모집 및 인슐린 유도 혈관 비만 주 커 쥐10,11손상 표시 되었습니다. 또한, 감소 모 세관 밀도와 마른 쥐 근육 인슐린 저항12표시합니다. 그들의 영향력 있는 작품에서 구보타 외. 장애인된 인슐린 내 피 세포에서 신호 인슐린 유도 microvascular 채용, 약 4013골격 근육에서 포도 당 통풍 관을 감소 감소 발생 보여주었다. Microvascular 기능에서이 이상이 발생 하지 않습니다만 다른 여러 조직 및 심장 등 장기에도 근육에서 망막 및 신장14,,1516. 이 예제와 다른 연구17,18,,1920 건의 인슐린의 혈관 효과 인슐린 저항 (patho) 생리학에서 중요 한 메커니즘의 합병증입니다.

인슐린 microvascular 혈액 볼륨 (MBV) 골격 근육5,6에 증가 하는 실질적인 증거는는 이런 메커니즘은 완전히 이해9하지. 피-종속 혈관 혈관 인슐린 감도21,,2223 는 맥 관 구조의 서로 다른 수준에서의 여러 측면에서 필수적 이다. 혈관 인슐린 감도 수 매니 페스트 자체 저항 동맥의 인슐린 유도 된 이완 및 사전 모 세관 arterioles 끼얹는다 microvascular 교환 표면적7,24, 증가 휴식 25.

Intravital 현미경 검사 법 (IVM) 조직 준비 마우스28 햄스터 뺨 파우치 마우스 등26,27마우스와 쥐 mesentery, 사지 허 혈의 모델의 피부 집계로 챔버 등의 다양 한 사용 되었습니다. 29. 대비 향상 된 초음파 (CEUS)은 심장30 골격 근육31에 미세 혈관의 평가 허용 하는 또 다른 이미징 기술. Rheologically 붉은 혈액 세포로 작동 하 고 혈관 루멘 내에서 유지 하는 불활성 가스 가득 microbubbles를 사용 합니다. 이러한 microbubbles 안정적인 상태를 달성 하기 위해 일정 한 속도로 정 맥 주입 됩니다. 높은 에너지 초음파 파도 다음, 파괴는 microbubbles를 사용할 수 있습니다. 관심 (ROI)의 지역에서 microbubbles’ 보급 속도 흐름 속도를 (MFV)를 나타냅니다. 대비 이미지의 총 신호 강도 MBV를 나타냅니다. CEUS (인간)에 반복 해 서 수행할 수 있습니다 그리고 그것은 (바 렛 외. 에서 설명 하는 인슐린 저항 상태에서 발생 하는 혈관 장애의 이해를 전진 했다 32)입니다.

현재 연구에서 우리는 IVM와 CEUS의 동시 사용을 통해 근육 관류의 공부에 대 한 새로운 기술을 설명 합니다. 여기 우리는 마우스 hindlimb의 내 전근 구획에서 인슐린의 혈관 작업에 초점. 이 구획 지역 포도 당 통풍 관 대표 근육에서의 연구 활성화 마우스, 큰 골격 근육 그룹 중 하나입니다. 이 구획은 IVM 준비 및 동맥의 시각화는 표준화 된 수술28에 의해 쉽게 액세스할 수 합니다. 또한, 우리 자신의 그룹과 다른 나타났습니다 CEUS이 구획33,34에서 사용할 수 있습니다.

결합된 IVM CEUS 기술 하는 장점은 큰 arterioles (피드 또는 저항 동맥)와 같은 근육 그룹에 미세 (모 세관 침대)의 수준에서 인슐린의 효과 평가 하는 가능성. 또한, 두 가지 방법 동시 적용 인슐린 저항 동맥 미세 혈관의 수준에서의 임시 작업에 대 한 통찰력을 제공합니다. 와이 결합 IVM CEUS 기술은 다른 혈관 생물학 분야에서 구현할 수도 있습니다. 예를 들어 다양 한 단백질 및 endothelium에 영향을 미치는 특정 병 태 생리 조건 역할 녹아웃 모델을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 또한, 두 기법 연구의 비용과 시간을 줄이고 여러 시간 점에서 한 마우스에서 사용할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험 지역 동물 보호 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. 전체 프로토콜 hyperinsulinemic euglycemic 클램프의 끝까지 마우스 마 취의 유도에서 약 2 시간 걸립니다. 1. microsurgical 준비 함께 남성 마우스 14 h 후 20-25 g를 무게에서 무 통 마 취를 유도 또는 펜타닐 (0.31 밀리 그램/kg), Midazolam (6.25 mg/kg) 및 Acepromazine (6.25 mg/kg) (FMA 마 취)의 복 주사와 금식 밤새 고에 직장 온도 제어 homeothermic 난방 패드를 37 ° c.에 온도 유지 작업 테이블과 여러 번 알코올 기반 솔루션을 사용 하 여 장비를 소독. 10 cm 긴 폴 리 에틸렌 관 (PE-20)에 27g 바늘을 연결 하 고 4-방법은 커넥터에 튜브를 연결. 꼬리 정 맥에 바늘을 삽입 하 고 조직 접착제 젤을 사용 하 여 그것을 흥분 시키는. 이 정 맥 마 취, 포도 당, 인슐린, microbubbles의 주입에 사용 됩니다.참고: 추가 헤 파 린 (5 U/mL)는 cannulation 동안 멸 균 식 염 수에 꼬리 정 맥 (약 10 µ L)를 프로세스 막힌된 뉼의 가능성을 줄여줍니다. 수술 절차 및 실험 프로토콜을 통해 FMA 33.75 µ L/kg/min의 속도로 꼬리 정 맥 캐 뉼 러를 통해 마 취의 지속적인 정 맥 주입 하 여 마 취를 유지 합니다. 복 부 쪽으로 마우스를 놓고 발 위쪽 허벅지 영역을 노출 하는 내 테이프를 사용 하 여 수정 합니다. 무릎 관절에서 고관절 (hindlimb 발 위로 향하도록)과 40-60 ° 각도의 약간의 exorotation를 사용 하 여 표준화는 허벅지의 내 전근 구획에서 근육의 스트레칭. 사 타 구니와 위쪽 허벅지 영역 depilatory 크림을 사용 하 여 양측에 머리를 제거 합니다. 습 한 면봉으로 모든 느슨한 머리를 수집 합니다. 아래는 stereomicroscope 마우스 놓고 10 X 16 X 확대를 사용 하 여 다음 수술 단계를 수행 합니다. 피부 위 사 타 구니 인 대, 복 곡률 (그림 1) 그냥 옆에 병렬 실행을 사용 하 여 2 cm 절 개를 확인 합니다. Distally 불독 클램프 (그림 1D)를 사용 하 여 절 개의 원심 측에 견인을 적용 합니다. 이것은 필요에 따라 윈도우를 조정 하 여 파라핀 오일 (1.12에서 설명)를 개최 하는 데 도움이 도움이 됩니다. 복 벽에서 지방 조직 해 부. 출혈을 방지 하려면 부드럽게 패드를 통해 직접 해 부 대신 벽에서 지방 패드를 분리 합니다. 원심 방향에서 지방 패드에 부드러운 견인 과정 (그림 1C)을 촉진 한다. 대 퇴 동맥을 확인 하 고 첫 번째 주요 지점 (상 복 부 동맥 및 gracilis 동맥) 아래로 따르십시오 (그림 2). Gracilis 동맥 내 전근 매 그 너 스 근육에서 실행 되는 대 퇴 동맥의 첫 번째 주요 지점 이며 다음 gracilis 근육에 깊은 실행 됩니다. IVM gracilis 동맥 사용 될 것입니다. 투명 한 깊은 근 막 근육 및 혈관을 식별 합니다. 날카로운 집게를 사용 하 여 근 막 위쪽으로 끌어 하 고는 microscissor를 사용 하 여 그것을 잘라. 약 액체 파라핀의 방울 (200 µ L)로 노출된 근육을 커버 온도, 룸 (37 ° C에 미리 데워) 준비 조직 밖으로 건조 하지 않도록. 기름 방울 떨어져 누설 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 불독 클램프 혈관 목욕 파라핀 기름을 보유 하는 작은 구멍을 사용 하 여 절 개의 피부 주름을 조정 합니다. Gracilis 동맥은 컴퓨터 화면에 수직 하는 방식에서 (16 배 광학 확대) 이전 보정 현미경 마우스를 놓습니다. 카메라와 컴퓨터에 현미경을 첨부 이미지 데이터 집합에서 혈관의 직경을 추출할 수 있는 분석 시스템을 기반으로. 선박의 luminal 양측 사이의 거리입니다. 지속적인 모니터링 및 동맥 직경의 측정 하는 것이 바람직합니다. 줄이기 위해 빛에서 머리 전도 hindlimb에서 충분 한 거리 (최소 20 cm)에 광원을 배치 합니다. Prewarmed 초음파 변환 젤 상단 contralateral hindlimb에 적용 됩니다. 대 퇴 골 뼈의 긴 축에 수직인 초음파 프로브를 놓습니다. 조심 스럽게 내 전근 근육 그룹의 횡단면 뷰를 초음파 프로브의 방향과 각도 조정 합니다. 마우스를 기준 초음파 프로브 위치 기준 및 hyperinsulinemic 측정 같은 영상 평면을 유지 안정 유지 처리. 30 분 동안 안정화 마우스를 하자. Gracilis 동맥의 직경 기준 직경을 문서화 하기 전에 10 분 동안 안정 해야한다. 2. 기준선 및 Hyperinsulinemic 측정 기준선 gracilis 동맥 직경은 IVM에 사용 되는 컴퓨터 프로그램에 의해 저장 되는 것을 확인 하십시오. Coulter 2.5 x 실험 직전 109 거품/mL의 농도에 카운터와 설명된35 및 카운트 microbubbles 사전에 준비 합니다. 으로 microbubbles 초음파 기계의 대비 모드 에서만 볼 수 있습니다, 이미지에 영향을 미치는 매개 변수를 제어 대비 데이터 수집 (에서 설명된 2.3.1)와 사용 중 지속적으로. 초음파 기계에 다음 설정 사용: 35 데시벨;에 대비 이득 시간 이득 OFF;로 보상 선 밀도 높은; 넓은;에 초점 영역 수 전송 전원 4%; 표준; 빔 폭 송신 SV 게이트 4; 감도 1; OFF로 지 속성입니다. 관심의 영역 중심에 초점 영역의 위치 레벨. 짧은 저장 (5 s) 클립. 이 배경 신호를 계산 하기 위해 사용 됩니다. 균일 한 현 탁 액을 손으로 microbubbles 들어 있는 유리병을 흔들어. 5 µ L/min 속도로 꼬리 정 맥 캐 뉼 러를 사용 하 여 microbubbles를 일으키는 시작 합니다. Microbubbles의 균일 한 현 탁 액을 유지 하기 위해 진동 소용돌이 (분 당 200 x)에 주입 튜브를 놓습니다. 정상 수준에 도달할 수 있도록 microbubbles의 지속적인 주입의 5 분을 허용 합니다. Microbubbles 주입 (그림 3A)의 시작 후 5 분 및 10 분에서 초음파 기계에 microbubble 폭 기능 (MBD)를 사용 하 여 거품의 시간-강도 곡선을 얻기와 진행. 이 두 측정의 평균 신호 초기 관류 데이터를 가져가 라. 취득 후 초기 계획 데이터 설명된34로 hyperinsulinemic euglycemic 클램프를 시작 합니다. (1.3에 배치) 꼬리 정 맥을 사용 하 여 인슐린과 포도 당 (과 마 취). 즉, hyperinsulinemic 국가 20%의 변수 주입 60 분 사용에 대 한 지속적인 인슐린 주입 (7.5 뮤/kg/min)에 의해 따라 200kg 뮤 인슐린 bolus를 도입 하 여 유도 euglycemia 유지 하기 위해 D-포도 당. 포도 당 모니터링 장치, 5 분 마다 꼬리 정 맥에서 혈액 포도 당을 평가 하 고 5 m m 가변 포도 당 주입 비율을 조정 하 여 유지. 지난 30 분 동안 평균 포도 당 주입 율을 평균 하 여 인슐린 감도 결정 합니다. Gracilis 동맥의 직경은 컴퓨터 프로그램과 hyperinsulinemic euglycemic 클램프의 시작 (예: 10, 30, 60 분)에 원하는 시간 기간에서 문서화 되어 있는지 확인 합니다. 25 분 후 또는 인슐린 클램프의 55 분 각각 30 / 60 분 MBV를 두 번째 (hyperinsulinemic) CEUS 측정을 시작 합니다. 2.4와 2.5에 설명 된 동일한 단계를 따릅니다. 분리 하 고 4-방법은 커넥터의 마 취 포트를 사용 하 여는 microbubbles 달 이다. Microbubbles 주입의 끝 후에 마 취 튜브를 다시 연결 합니다. IVM와 인슐린 주입의 CEUS 측정 시작 후 60 분 후, 나중에 분석 마음 빵 꾸 절차 사용 마우스에서 혈액을 철회. 이 마우스를 안락사 또한 것 이다. 조심 스럽게 gracilis 및 대 퇴 동맥 해 부 고 추가 원하는 실험에 대 한 그들을 저장 (대 한 예를 들면, 서쪽 오 점, Immunohistochemistry, 비보 전 압력 myography 실험36,37, 38). 3. 오프 라인 분석 참고: IVM 및 CEUS 측정 분석 멀게 탐정에 의해 오프 라인으로 수행 되어야 한다. CEUS는 microbubbles MBD 함수를 사용 하 여 강도 높은 초음파 파도 의해 일시적으로 파괴에 의해 큰 혈관에서 미세 혈관을 구별 하는 가능성을 제공 합니다. (임의의 단위 (호주산) 측정) 더 큰 혈관에 신호 때문에 해당 선박에 microbubbles 속도 미세 혈관에 비해 빨리 복원 됩니다. 분석을 할 초음파 기계에는 오프 라인 워크스테이션 또는 소프트웨어를 사용 합니다. 이익 (ROI)는 미세를 포함 하도록 영역을 그립니다. 더 큰 대 퇴 혈관 (그림 3A)를 포함 하는 별도 투자 수익을 그립니다. 소프트웨어에 내장 된 ROI 복사 기능을 사용 하 여 배경, 기준선 및 hyperinsulinemic 측정에 대 한 큰 혈관 및 미세 혈관의 ROIs를 중복. 기준선에서 배경 측정과 hyperinsulinemic 측정의 강도 신호를 뺍니다. 대 퇴 혈관의 강도 신호에 의해 microcirculation의 강도 신호를 나눕니다. 기준선과 hyperinsulinemic MBVs 이제 비교할 수 있습니다.

Representative Results

포도 당 주입 율 hyperinsulinemic euglycemic 클램프 (인슐린 감도) 동안은 180.21 ± 19.81 µ / k g/분 배를 안정 시키기 위해 내 전근 근육 격실에 파라핀 오일의 로컬 응용 프로그램 평균 기준 직경을 변경 하지 않은 동맥 (73.6 29.0 ± µ m 68.8 ± 17.9 µ m; 대의 p = 0.58) 하지만 변화를 줄이기 위해 도움이 동물 테스트 (그림 4A). 인슐린 일관 gracilis 동맥 직경 (14.58 ± 6.2% 증가 60 분; N = 9)는 크게 달랐다 (p < 0.0001) 식 염 수 주입으로 인 한 직경 변화에서 (-6.3 ± 4.9%; N = 6). 10 분 (10.09 ± 5.1%; 후 인슐린 유도 된 혈관은 감지할 수 p = 0.002) 30 분 후 최대 완만 용량의 약 95%를 도달 했다. CEUS에 사용 하 여, 인슐린 일관 되 게 증가 근육 MBV (그림 5A) 33.5% (± 31.04%, N = 7; p = 0.0009) 식 염 수 주입에 비교 될 때 (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (그림 5B). 제공 된 데이터는 근육 대 퇴 혈관을 나눈 MBV의 신호 강도. 다른 쥐 (데이터 표시 되지 않음) 그리고 다른 측정 사이 실험 변형을 줄어듭니다. 대 퇴 혈관에서 신호 강도 선형 microbubbles 순환 (그림 3C)의 농도와 일치합니다. 이론적으로 대 퇴 혈관 신호에 대 한 수정 microbubbles 사용 (그림 3D)의 농도 차이 해결 합니다. 데이터는 ± 표준 편차를 의미 하기 때문에이 섹션에 표시 됩니다. 그림 1: 는 Hindlimb의 내 전근 구획의 외과 박람회. (A) 절 개는에서 만든 사 타 구니, 사 타 구니 인 대의 방향에 평행 하 게. (B) 부드러운 견인 원심 방향 (검은 화살표)에서 지방 패드에서 지방 패드와 복 벽 사이의 결합 조직 (*)를 발표할 예정 이다. (C)는 피부 주름 절 개의 혈관 목욕 파라핀 기름을 보유 하는 작은 구멍을 만들 불독 클램프를 사용 하 여 조정할 수 있습니다. (D) 초음파 프로브 보정된 현미경을 사용 하 여 준비 gracilis 동맥을 본 이후 contralateral 위 hindlimb에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 마우스 Hindlimb intravital 현미경. 대 퇴 동맥 (A) (B) 상 복 부 동맥 및 내 전근 근육 그룹 (D) 실행 gracilis 동맥 (C) 상승을 제공 합니다. Gracilis 동맥 IVM 보정된 현미경을 사용 하 여 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 대비 향상 된 근육 Microvascular 혈액 볼륨 및 대 퇴 혈관 초음파의 강도 신호. (A) 비선형 대비 남성 마우스 상단 hindlimb에 microbubbles 지속적인 주입 하는 동안 디지털 이미징 플랫폼의 모드 영상 보기 오른쪽 패널: 두 ROIs MBV 근육과 대 퇴 혈관을 나타내기 위해 그려집니다. 내 전근 근육 구획의 표면 부분은 포함만 신호도 투자 수익에 깊이와 강도 감소. 왼쪽된 패널: 근육 MBV 투자 수익에서에서 시간-강도 곡선. 세로줄 높은 에너지 파 microbubbles (MBD)의 파괴를 나타냅니다. MBD, 직후 아무 대비 에이전트는 microbubbles 점차적으로 채우기 위해 시작 영상 평면에 존재. 10-15 s 후 대비 향상의 피크에 도달 했습니다. (B-D) 2.5 x 109 거품/mL의 주입 속도 두 배로 후 정상 상태 신호 도달 되었다, (5, 10, 20 µ L/min). 신호 강도에서 근육 MBV (B)와 (C) 대 퇴 혈관 paralleled 순환에서 microbubble 농도의 2 배. (D) 수정 근육 MBV 대 퇴 혈관 신호 제거 다양성 다른 microbubble 농도 의해 발생 하는 신호 강도에 대 한 (N = 9; 표준 편차 나타내는 오류 막대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: Gracilis 동맥의 intravital 현미경 측정. (A) 파라핀 오일 평균 기준 직경 안정 (73.6 µ m 68.8 µ m; 대를 유지 하면서 (이 석유를 적용 한 후 파라핀 vs 17.9 µ m 없이 29.0 µ m) 다른 동물의 gracilis 동맥의 변화를 감소 p = 0.58). (B) 간선 직경 인슐린 또는 염 분 약 60 분 전후 기준에서. 인슐린 후 60 분 주입 지속적으로 열려진 gracilis 동맥 (p < 0.0001) 식 염 수 주입에 비교 될 때. (C) 인슐린 유도 된 혈관 주입 시작 후 10 분에 발생 (p = 0.002) 30 분 오류 바 대표 표준 편차;에서 최대의 95%에 도달 짝이 없는 학생의 T-검정 통계에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: 대비 향상 된 마우스 Hindlimb의 내 전근 근육 구획의 초음파를 사용 하 여 microvascular 혈액 볼륨 측정. (A) 인슐린 인슐린 주입 시작 후 MBV 30 분에 일관 된 증가 있는 결과. (B)는 hyperinsulinemic 및 기준선 측정 (MBV 변경)의 차이 인슐린 중재 microvascular 모집으로 표시 됩니다. 인슐린 유도 33.5% (± 31.04%, p = 0.016; N = 7) 식 염 수 주입에 비해 microvascular 모집 (-10.63 ± 27.87%, N = 6). 오차 막대를 나타내는 표준 편차; 짝이 없는 학생의 T-검정 통계에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

우리는 동시에 인슐린의 혈관 작업 (IVM 사용) 하는 큰 동맥에 골격 근육 미세 (CEUS 사용)를 추정 하는 기법을 개발 했습니다. 성공 하 고 안정적인 측정을 위한 중요 한 단계는: 1) 올바르게 gracilis 동맥 출혈; 없이 노출 2) 동맥; 입욕 파라핀 오일의 누설 방지 3) 데 vasoactive 화합물 (인슐린) 및 대비 에이전트 (microbubbles)의 주입에 대 한 특허 정 맥 접근 (꼬리 정 맥 정 맥).

근육에 microvascular 역 기능 연구 비만 인슐린 저항14,25,,3940의 맥락에서 관심을 얻고 있다. 비만 인슐린 저항 혈관 기능에 부정적인 영향을 포함 혈관 나무의 다른 수준에 명시 됩니다. 이제부터, 다른 접근 이러한 변화를 평가 하기 위해 필요 합니다. IVM 및 CEUS 같은 마우스 기술 사용 하는 맥 관 구조의 서로 다른 수준에서 인슐린의 효과 계량 강력한 도구를 제공 합니다. IVM 직접 시각화 및 저항 동맥의 정량 분석을 허용 하 고 CEUS 근육 관류의 인슐린 유도 된 변화에 대 한 평가 대 한 있습니다.

내 전근 근육 격실을 공부 하 고 몇 가지 장점이 있습니다. 동맥 쉽게 접근할 수 있으며 절 개의 표면 특성 실험 완료 후 5.0 흡수 멸 균 봉합 사를 피부 절 개를 닫으려면 가능 하 게. 동물 주사 피하 buprenorphine 실험 후 0.1 mg/kg의 복용량에 진통제로 되었고 따뜻한 환경에서 복구할 수 있습니다. 쥐 절차를 아주 잘 용납 하 고 우리는 동물의 손실 없이 35 개 이상의 동물 공부 hindlimb의 감염을 경험. 이 후속을 가능 하 게 하거나 경도 패션에 동물을 공부 합니다. 그러나이 실험에 사용 된 동물, 1.8% 흡입 isoflurane 마 취 마스크 하지만 0.4 L/min에서 흐르는 산소와 균형을 사용 하 여 취 했다. 달리 isoflurane 마 취41,42, FMA 마 취는 주변 인슐린 감도 방해 하지 않습니다. 미래의 계획은 쥐 FMA 마 취에서 회복 하는 얼마나 잘 공부 이다.

내 전근 근육 구획 또한 유용한 다양 한 vasoactive 화합물 로컬 중재 이후 이며 다운스트림 혈관 효과 평가할 수 있다. 예를 들어 대상 조직에 이러한 화합물의 국 소 응용 프로그램은 가능한 superfusion 기법28 또는 수술 조작 및 약물 방출 수 갑을 둘러싼 혈관43의 주입을 사용 하 여. 또한, gracilis 동맥 격리 하 고 압력 myograph에서 공부 될 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 압력 myograph를 사용 하 여이 동맥 비보 전36,,3738. 에 인슐린과 다른 vasoactive 화합물의 효과 문서화 하는 실질적인 실험 증거 수집

IVM 기술의 사용에 제한 근육의 수술 박람회 및 혈관을 안정화 하기 위해 파라핀 오일의 응용 프로그램입니다. 그것은 이러한 작업 동맥의 네이티브 환경 영향 여부를 명확 하지입니다. 그러나, 그림 3A gracilis 동맥 파라핀 기름에서 목욕의 초기 직경 상당히 변경 되지 않습니다 보여 줍니다. 그것은 또한 보였다 미네랄 오일 hyperoxic 조건44에서 조직을 보호 하는 산소의 확산을 성공적으로 억제 한다. 또한, 기름 동맥의 초기 직경에서 변화를 줄일 수 있습니다. 이 때문에 우리는 파라핀 오일을 사용 하 여 적어도 30 분 동안 준비 나머지 옹호. 노트의 오일-또는 석유 대신 버퍼링 된 염 분의 사용-결과 높은 변수 지름과 선박 (데이터 표시 되지 않음)의 수축. 또한, 실험의 끝에, 우리 절연 gracilis 동맥-파라핀 오일-목욕 그리고 압력 myograph에 그들의 반응성을 테스트 비보 전. 파라핀 오일 목욕 동맥 동맥 때 인슐린과 아 세 틸 콜린 (vasodilator) 자극을 제어 마찬가지로 반응 (데이터 표시 되지 않음). 일관 된 인슐린 유도 된 혈관은 명확 하 게이 연구에서 설명 IVM 프로토콜 신뢰할 수 있는 결과 생성 보여줍니다.

같은 마우스 기술을 모두 적용의 장점은 다른 하나의 기술의 본질적인 제한 중 일부를 극복: CEUS에 그대로 근육 vivo에서, MBV 추정 하지만 개별 혈관을 볼 수 없습니다; IVM 수 있습니다 개별 선박 볼 이라도 MBV를 예측할 수 없습니다. 미래의 계획은 CEUS contralateral 편이 내 전근 근육의와 조합에 cremaster 근육의 IVM 현미경 검사 법을 활용 하는 것 이다. 이 수정 (CEUS 사용) MBV (IVM 사용) 하는 모세 혈관에 직접 광 액세스의 견적을 제공할 수 있습니다. 프로토콜 추가 수정할 수 있습니다; 4-방법은 커넥터 꼬리 정 맥에 사용 되는 5-방법은 커넥터를 전환할 수 있습니다. 이것, 우리는 두 번째 CEUS 측정 (포인트 2.9에서에서 설명)을 수행 하는 동안 마 취 튜브를 분리 피할 수 있다. 우리의 경험에서 쥐 잘 현재 프로토콜을 용납. 이 프로토콜을 만들 수 있는 또 다른 수정 사용 인슐린 클램프 속도입니다. 우리는 위에 생리 여겨지는 7.5 뮤/kg/min 클램프 속도 사용 합니다. 연구에 따라 더 낮은 인슐린 클램프 비율 (예를 들어 3 무/kg/min)를 사용할 수 있습니다.

발견 설명된 프로토콜 신뢰할 수 있는 하는 동안 주의 필요로 하는 특정 제한이 있습니다. 동맥 직경의 측정은 최적의 상황이 있습니다. 준비 단계를 실행 모델과 함께 몇 가지 경험을 요구 한다. 그것은 중요 한 선박을 교란 하 고 동맥 나머지 다른 30 분 동안 하는 데 필요한 만들기 지름을 변경할 것 이다 새로운 오일으로 보충 파라핀 오일 선박 환경에서 누설 하지 않습니다. 또한, 파라핀 오일의 표면에 (1.14 프로토콜의 단계에서 설명) 빛의 반사 너무 밝고, 동맥을 볼 수 어렵습니다 가끔 했다. 이 광원 빛 파라핀 오일 표면과 동맥에 평행 하 게 각도에서 폭포를 지시에 의해 counteracted 수 있습니다.

결론적으로,이 연구에서 설명 IVM 및 CEUS 기술 조합은 맥 관 구조의 서로 다른 수준에서 인슐린의 다양 한 효과 계량 수 있습니다. IVM gracilis 동맥의 다운스트림 microvascular 관류 CEUS를 사용 하 여 측정에 기여 업스트림 혈관 변화에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 우리는 혈관 기능을 평가 하는 더 나은 동일한 마우스에서 여러 실험적인 기술의 조합을 옹호.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 Ing을 감사합니다. 이 연구에 사용 된 이미지 분석 소프트웨어 (ImageGrabber) 프로그래밍에 대 한 던컨 반 녹색. 이 연구는 제공에 대 한 자금 과학 연구 (grant 016.136.372)를 위한 네덜란드 조직에서 VIDI 그랜트에 의해.

Materials

C57BL/6 Mice Charles river Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009 Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex VWR international 58815-234
Heating pad  Pantlab
Freestyle Precision Xceed  Abbott To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid Novo Nordisk
Glucose monohydrate  Merck Millipore 1083421000
Buffered saline solution B. Braun 152118062
PE-20 medical tubing Becton, Dickinson and Company 427405
Needle, 27 Gauge  Becton-Dickinson & Co 305109
Medical tape 3M
Ultrasound probe holder Built In-house
Cotton swabs Multiple Equivalent
Creme depilator Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive Derma+flex GA30005-2222
Infusion pump Harvard Apparatus Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
Needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
Stereomicroscope Olympus SZX12
Camera Basler scA1390-17gc
Image Grabber program Built in-house Image acquisition system
Timer VWR 33501-418
Syringes, 1 ml Fisher 14-817-25
Light source, fiber-optic Schott KL1500 Ideally has adjustable arms
Paraffin oil Multiple Equivalent
Name Company Catalog Number Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850365C
polyoxyethylene stearate   Sigma p3440
perfluorobutane gas  F2 Chemicals C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath  Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix  Lantheus Medical Imaging 515370-0810
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter Inc
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Referencias

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Intravital MicroscopyContrast-enhanced UltrasonographyMouse HindlimbInsulin-induced VasodilationMuscle PerfusionType 2 DiabetesObesityInsulin SensitivityOrgan Blood FlowCD57 BL6 Male MouseAdductor CompartmentFemoral ArteryEpigastric ArteryGracilis ArteryDeep FasciaParaffin Oil

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Turaihi, A. H., van Poelgeest, E. M., van Hinsbergh, V. W. M., Serné, E. H., Smulders, Y. M., Eringa, E. C. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. J. Vis. Exp. (121), e54912, doi:10.3791/54912 (2017).
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