High-density Elektroencefalografisk Acquisition i en gnaver Model Brug Lavprisselskaber og Open source Ressourcer

Undersøgelserne udføres i hele denne undersøgelse var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Pennsylvania. 1. medaljon design og konstruktion Fjern hver ottende række stifter fra 2 x 50 pin mursten af ​​en 100 position hunkonnektor med en pincet ved at skubbe modtagedelen af ​​tappen gennem plastik mursten. Bemærk: Pins vender nedad vil være den orientering, som vil blive refereret i resten af ​​protokollen. (Vær opmærksom på dette specifikt i 2.6). Dæk pins med et meget tyndt lag neglelak til at isolere og lad neglelak tørre helt. Fjern neglelak fra spidserne af stifter med acetone og en lille klud. Klip overskydende plast af 2 x 7 s ved hjælp af et barberblad eller wire-skæring pliers. Dette vil resultere i 2 x 7 klodser, som er isoleret langs længden af ​​tappene og eksponeret på pin spids. Disse vil i sidste ende blive de Transkranial EEG elektroder. To 2 x 7 klodser er nødvendige for en komplet kronisk elektrodesæt (figur 1A). Skær to 1 x 2 pin mursten til EMG signal optagelse. Brug den samme proces med at fjerne uønskede pins med pincet og skære det overskydende plast væk for at skabe de 1 x 2 klodser. Sørg disse 1 x 2 s har en glat side til dem fra de oprindelige 100 Position Beholder da denne afstand vil blive standard pin afstand for hver medaljon, så en enkelt adapter vil arbejde for alle headpieces (figur 1A). Brug 2-del epoxy til at fastgøre 1 x 2 pin brik til 2 x 7-pin stykke (Figur 1D). Som begge sæt stifter skal være i den samme orientering, epoxy 1 x 2 på den laterale side af begge halvdele af hovedstykket med glatte sider af 1 x 2 og 2 x7 i kontakt med hinanden. Flugt de 1 x 2 små huller og tappe med de bageste-mest 2 rækker pins på 2 x 7. Bemærk: De to halvdele af hovedstykket ikke epoxied sammen. Dette giver mulighed for fleksibilitet inden for de to halvdele af hovedstykket adapter til lettere forbindelse under tilvænning og under eksperimentelle dage (figur 1E). Lad hovedstykket halvdele helbrede natten over. Efter endt hovedstykket er bilateralt symmetrisk. Hver halvdel består af en 2 x 7-pin mursten med en sideværts vedhæftet 2 x 1 pin mursten, der er i overensstemmelse med den bageste fleste 2 rækker af 2 x 7-pin mursten. Forbered ledninger til EMG signal optagelse. Enkelt strenget, er 31 G perfluoralkoxy-isolerede sølvtråd bruges til EMG-signal optagelse (Figur 1D). Imidlertid multi-strengede eller et andet metal ledningsføring kan erstattes, hvis det ønskes. At skabe thorax EMG ledninger tage en 3,0 cm langt stykke perfluoralkoxy-isolerede sølvtråd og remove 1 cm af plast isolering fra den ene ende med et barberblad. Pak ikke-isolerede ledninger omkring en pincet to gange. Fjern ledningen fra pincet og fjern 25 mm isolering på den ikke-loopes ende med et barberblad. At konstruere cervikale EMG ledninger, gentag processen med en 1,5 cm segment af wire. Man bør være to cervikale EMG ledninger og to thorax EMG ledninger for en komplet medaljon. Fjern den laterale pin i længst forreste række i begge headpieces, hvilket svarer til en stereotaksiske koordinater 3,3 mm anterior af Bregma og 2,3 mm lateralt for Bregma, da der ikke er hjernen under denne placering som bestemt ved en musehjerne atlas 20 (figur 2A). På begge medaljon halvdele, skåret nålene på 1 x 2 mursten til plastbasen af ​​hovedstykket med en skævbider (3,0 mm fra spidsen af ​​stiften) og lodde den cervikale EMG ledning til den forreste bens og thorax EMG den posteriore pi. Kontroller at hver stift er elektrisk isoleret. Udfør en kontinuitet test med et digitalt multimeter ved at forbinde de to ledninger af voltmeter til forskellige stifter, mens i kontinuitet tilstand. Elektrisk isolerede ben vil ikke producere en hørbar bip med dette multimeter test; dog elektrisk koblede stifter vil. Dæk loddede samlinger med neglelak og en gang tør, bøje EMG ledninger, således at de er i parallel til den forreste / bageste akse med minimal sideforskydning. Trim stifter til en relativ længde, således at de passer overfladeprofilen af ​​hjernen. Med aide af en mus hjerne atlas, rekord ventrale afstand til hjernen overflade fra Bregma for hver pin koordinat. 20. Stiften hvis ventrale afstand fra Bregma er den største vil tjene som indikator for pin trimning. Denne pin vil ikke blive trimmet, mens alle andre ben vil blive skåret med hensyn til denne maksimale ventrale afstand pin (tabel 1). Bemærk: Pins kan slibes ned til størrelse, men det skal gøres omhyggeligt, da friktionen mellem pin og slibeskive kan forårsage stifter af medaljon til at bøje. Hvis en tap er bøjet, skal du bruge pincet til at glatte det ud. Et alternativ til formaling stifterne ned til længde er at trimme dem med et par wire skæring tænger. Dække alle de pin tips med en sølv løsning med en sølv løsning pen og lad tørre. Dette trin sænker elektrodelag impedanser til ≤30 kQ, hvilket øger signal-støjforholdet og samtidig eliminerer de ru kanter forårsaget af pin trimning, derfor faldende chancer for vævsbeskadigelse og fremskynde genvinding fra kirurgi. En udfyldt medaljon halv vægte ca. 0,5 g. 2. Adapter Byggeri og Channel Mapping Klip ledningerne i en 36 Position Dual Row Mand Nano-miniature stik til en ensartet længde på 2 eller 3 cm ved hjælp af et barberblad. For hver ledning, strip off 2,5 mm isolering fra slutningen og tin den eksponerede metal til hver ledning. Sørg for, når fortinning at have en enkelt, tynd streng af fortinnet tråd for hver nano-adapter ledning da dette er afgørende for at isolere ben. Snip off strippet isolering med wire-skære tang (figur 1C). Opret en matchende han / han stik til medaljon hjælp af Conn Strip Header 2 x 50. Cut to 2 x 7-og to 2 x 1 er fra en 2 x 50 mursten. Fjern uønskede ben fra 2 x 50 mursten ved at bryde fra en af de mandlige ben, og skub den ubrudte anden halvdel af det samme stykke fra stik med en pincet (figur 1B). Bemærk: Den ene side af disse stifter vil tjene som adapter pins til stikket i hver medaljon, mens den anden halvdel vil blive loddet til de fortinnede nano stik ledninger. Sørg for at have de flade plastik kanter 2 x 1 og 2 x 7 rørende at sikre en korrekt parring af han / han stik med medaljon oprettede i trin1. Lod på en af ​​jorden / reference- ledninger fra nano-stikket til den ønskede jord / reference pin. Ground og reference- ledninger er bundet sammen på RHD2132 forstærker chip. Brug det enkelt pin, som er 0,60 mm anterior til Bregma og 1,00 mm lateralt af Bregma som både reference og jord. (Venstre headpiece, mediale pin af den tredje mest anteriore rækken, men enhver anden pin kunne tildeles, hvis det foretrækkes, figur 2.) Bemærk at det er muligt at adskille jorden og henvisning forstærkerchip ved at fjerne 0Ω modstand, der binder jorden og reference sammen, hvis der ønskes isolering af to. Lod de fortinnede nano stik ledninger til samme side af de mandlige / hanstik som pin-forbindelse jorden / reference. Hver ledning kort til en bestemt kanal, så kanalen setup kan være afsluttet på dette tidspunkt. Kanal kort diagrammer for forstærkeren headstages findes på Open Ephys Wiki websted (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). Lod den tilsvarende tråd, hvis kanal er kendt til den respektive tap at opnå den ønskede kortlægning. Skær ubrugte ledninger i bunden af ​​nano-stikket med wire skære tang. Brug et voltmeter til at sikre, at hver pin er elektrisk isoleret fra alle andre ben. Når isolation er bekræftet, anvende et tyndt lag neglelak omkring hver lodning fælles for yderligere at isolere hver pin. Brug 2-del epoxy, styrke den matchende nano-adapteren til de bilaterale 2 x 7 og 2 x 1 ben på de mandlige-mand mursten. Bemærk: Der vil være to halvdele til denne ene adapter, der passer til pin arrangement af medaljonen halvdele oprettede tidligere. Det er afgørende at sikre, at den mediale del af hver halvdel af adapteren ikke har overskydende epoxy overfyldte plast kant han / han stik, da dette vil forhindre begge halvdele af medaljon bliver tilsluttet på samme tid. Lad ikke nogen epoxy at strømme til undersiden af ​​bens adapter portion af adapteren, da dette ville også forhindre ordentlige forbindelser. Brug de 2 medaljon halvdele som en form for korrekt stik pin justering. Epoxy begge halvdele af adapteren og epoxy bunden af ​​nano stik til at øge holdbarheden. Vær sikker på at dække alle lodning samlinger med epoxy. Lad adapteren kur natten over. Bekræftelse af korrekt kanal kortlægning kan udføres ved hjælp af impedans målinger i Open-Ephys grafiske brugergrænseflade (GUI). En gennemført adapter vejer ca. 1,3 g (figur 1F). 3. Kirurgi Forbered en steril kirurgisk felt. Bær sterile handsker og andre personlige værnemidler efter behov. Sterilisere værktøjer i en autoklav. Steriliser stereotaktisk ramme med en 1,0 mM chlordioxidopløsning. Spray opløsningen på rammen og vent 5 minutter før skylning med sterilt vand. For at sterilisere implanterbar headpIECE dele, spray komponenterne med en 1,0 mM chlordioxidopløsning, og vent 5 minutter før skylning med sterilt vand. Placer nu sterile implanterbare hardware i en steril petriskål. Opnå en præ-kirurgisk vægt for musen, bedøver musen i en 200 ml induktion kammer under anvendelse 1,5-2,0% isofluran i 100% oxygen. Brug en strømningshastighed ind i kammeret på omkring 500 ml / min. Bekræft tab af balancerefleks ved at dreje induktion kammeret. Fjern musen fra induktion kammeret og sted i næsen kegle på stereotaktisk ramme uden fuldstændig fastholdelse musens hoved med øret barer. Fortsæt med at overvåge for korrekt dybde af anæstesi ved tå knivspids vurdering samtidig vurdere vitale tegn. Oprethold kroppens kernetemperatur ved 37 ° C med et lukket kredsløb temperaturregulator, såsom en rektal sonde og varmepude system. Dække øjnene af musen med oftalmisk øjensalve før afskæring pelsenpå toppen af ​​kraniet ved krum saks eller hækkesaks. Desinficer hovedet med betadin og lad betadin tørre helt, før du fortsætter. Administrere analgetika og antibiotika sammen med fluider intraperitonealt. For en 25 g mus, 0,5 mg cefazolin, 0,125 mg meloxicam, 0,5 ml saltvand og 2,5 ug buprenorphin q 4-6 timer prn. Indsprøjtes 250 pi 0,25% bupivacain subkutant langs midterlinjen på hovedet, og sprøjt 100 pi 0,25% bupivacain subkutant på begge kindbensbuerne med musen. Fastgør musen i stereotaktisk ramme og eksponere kraniet. Fastgør lederen af ​​mus med stereotaktisk øre barer til stereotaktisk ramme. Sikre, at musen er på en kirurgisk plan anæstesi ved at bekræfte fraværet af tå knivspids refleks. Opret en 1,5-2,0 cm snit sammen med en No. 11 engangs skalpel langs midterlinjen af ​​kraniet. Snittet starter fra mellem øjnene og fortsætter posteriort til nakkeknude. </ Li> Expose kraniet ved at sprede huden lateralt med mikro klemmer. Reducere isofluran koncentration fra 2,0% til en koncentration, som opretholder en kirurgisk plan anæstesi, men reducerer ikke lavere end 1,0% isofluran i 100% oxygen. Pre-operative analgesi reducerer mængden af ​​inhaleret bedøvelsesmiddel nødvendig for at opretholde en kirurgisk dybden af ​​bedøvelse, og kan føre til hurtigere helbredelse og forbedret overlevelse resultater. Niveau kraniet og bore burr huller. Identificer Bregma og nulstille stereotaktiske koordinater på Bregma, som bliver oprindelsen af ​​koordinatsystemet. Til niveau kraniet i den mediale / laterale akse, flytte en udjævning sonde fastgjort til en stereotaktisk manipulator arm 1,50 mm sideværts i begge retninger fra Bregma og bekræfte, at dorsale / ventrale dybde er mindre end 0,05 mm, når sonden kontakter venstre og højre sider af kraniet. Bemærk: De 10 um opløsning af dorsale / ventrale manipulator arm, som benyttes i forbindelse med en digital koordinatvisningen forenkler nivellering. Nivellering den anteriore / posteriore akse om Bregma følger den samme teknik. Forskellen i den ventrale afstand for at kontakte Bregma og Lamda bør også være mindre end 0,05 mm. Juster kraniet indtil nivellering er komplet i begge retninger, så det tværgående plan er parallelt med jorden. Dette giver mulighed for ægte stereotaktiske koordinater som set i mus hjerneatlas. 20 Med en 0,5 mm i diameter mikro bor inden for en stereotaktisk bore, bore burr huller fra 3,30 mm anterior til 4,50 mm posteriort for Bregma i trin 1.30 mm på 1,00 mm sideværts med midterlinjen på begge halvdele af kraniet. For 2,30 mm laterale kolonner af elektroder, til bore burr huller fra 2,00 mm anterior Bregma til 4,50 mm posteriort for Bregma i trin 1.30 mm på begge sider af midterlinjen (figur 2). Den høje nøjagtighed og præcision, der er påkrævet for denne drIlling drift er forenklet af den 10 um opløsning af en digital stereotaktisk manipulator arm. Bemærk: For at de stifter af medaljon til korrekt implanteres, skal kraniet af musen være sikkert på plads inden for stereotaktisk ramme. Hvis kraniet bevæger under boring, kan forskydning af medaljonen og burr huller opstå. Implantere headpieces. Med lige pincet, forberede EMG wire tunneler for thorax EMG ledninger. Graver 2,5 cm mellem huden og musklen i ryggen for både venstre og højre EMG ledninger. Sæt thorax og cervikale EMGS ind i hulrummet oprettet med de lige pincet først, og derefter manøvrere EEG mursten med buede pincet, således at stifterne tilpasse med de tidligere borede burr huller. Påfør et let tryk på headpiece og vrikke stifterne ind i kraniet. Pin-diameteren er 0,46 mm. Med isolerende neglelak, vil stifterne passer stramt i det borede grat holes. Hovedstykket vil være stabil, når den er passende indsat. Juster EMG ledninger til de endelige positioner. Gentag den samme fremgangsmåde til hovedstykket på den anden side. Fastgør medaljon på plads ved hjælp af dental cement. Når begge headpieces er sat på plads, bland 1: 1-forhold mellem methylmethacrylat med sin tværbindende forbindelse. Påfør blandingen, således at den dækker den blotlagte kraniet, søm-polerede dele af pin-elektroder, og proximal del af EMG ledninger, men dækker ikke de kvindelige beholdere af medaljon. Vær sikker på at ikke få cement på pels. Lad ikke for kamme af cement til at danne at musen vil være i stand til at gribe ind. Sørg for tilstrækkelig tid til cementen tørre, og derefter fjerne musen fra stereotaktisk ramme. Den samlede vægt at musen vil skulle bære er fra 2 halvdele af hovedstykket og sikring cement er ca. 1,2 g. Sende dyret i en renopsving område. Oprethold kroppens kernetemperatur med en varmepude. Overvåg musen, indtil det genvinder alle posturale reflekser, der betyder fremkomsten af ​​anæstesi. Individuel boliger anbefales til langvarig genopretning. Daglig overvågning i mindst 3 dage efter operationen anbefales med interventionel analgesi. Tillad 10-14 dage for inddrivelse postoperativt før du starter en tøjret tilvænningsperiode. 4. vænne Dyr til Tethering Tilslut adapteren til musen bruge en mus nakkestøtte (Figur 1G-H). Hold på modsatte hjørner af headpieces, der er cementeret på plads med buede hemostats når musen er behersket og indsætte langsomt adapteren ben i den implanterede medaljon på begge sider. Tilslut 32 kanals forstærker til adapteren (figur 1 H). Sørg for at justere de logoer på både adapteren og forstærker i en consistent orientering for både adapteren og forstærkeren for at forhindre kanal-kortlægning fejl. Tilslut forstærkeren til en RHD2000 standard seriel perifer interface (SPI) kabel. Dette kabel vil forbinde til købet for signal optagelse. Placer musen i et kammer, der har en udliggerarm installeret på kammervæggen. Fastgør SPI interface kablet til udkragningsarm og justere spændingen i udkragningsarm at modvirke vægten af ​​den bundne kabel. Musen er i stand til at bevæge sig frit og er habituated til en time om dagen i ugen før optagelse. For at afbryde musen, skal du blot tage kablet og adapter fra musen, mens du bruger en flad rustfrit stål mikro spatel til aide i at afbryde adapteren fra musen. 5. Signal Extraction Systemopsætning / Signal optagelse Sæt den beregnede adapteren i medaljon af en implanteret mus. Slut en hovedtrin forstærker til adapteren ogvedhæfte en standard SPI interface kabel til forstærkeren og til overtagelsen bord. Har SPI kablet tillægger en korrekt spændt cantilever så den ekstra vægt på musens hoved minimeres. Placer en lokal Faradays bur, skabt ved hjælp af ledende maske eller aluminiumsfolie, omkring hovedtrin og jorde den lokale Faradays bur. Opnå elektrode impedanser før begyndelsen af ​​hver optagelse ved at vælge en 30 kS / sek sampling rate og måle impedanser via modulet i GUI. En impedans værdi mindre end eller lig med 10 kohm for en individuel pin er nødvendig for bekræftelse af korrekt elektrode kontakt. Højere impedansværdier medfører afviste data fra denne elektrode. Til optagelse, skabe et signal kæde af Rhythm FPGA, båndpasfilter, og LFP fremviseren i GUI. Det anbefales at vælge en sampling rate på 1,00 KS / s, båndbredde på 0.1-7,500 Hz og fravælge DSP. Indstil Bandpass filter til 0,1-250 Hz og vise kanaler ved opkelse af LFP seeren. 250 og 400 μV kanal amplituder med draw metode udvalgte bedst visualiserer data. Begynd optagelsen ved hjælp af GUI. Opret en ny mappe for hver optagelse og angive stien til at gemme filer til denne mappe. Til at begynde en optagelse simpelthen hit rekord. Alle 32 kanaler fra stikket registreres som standard, men uønskede kanaler kan fravalgt ved at klikke på højre side af Rhythm FPGA modulet før begyndelsen af ​​optagelsen. Importer data til Matlab til analyse. Der er en lang række open source værktøjskasser, der kan bruges til at hjælpe i analysen.