정량적 마이크로 중화 분석의 최적화
Summary
이 연구는 설명 영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
마이크로 중화 (MN) 분석은 중화 항체의 정량과 항 바이러스 활동 바이러스학에 사용됩니다. 혈구 응집 억제의 대안으로 (HI) 분석, MN의 분석은 HI의 해석은 1,2,3 결과 복잡하게 수용체 결합 인플루엔자 바이러스에의 선호도 변화에 의해 영향을 비 항원 효과를 극복 할 수있다. 최근까지 대부분의 MN의 분석은 세포 변성 효과 (CPE) 또는 효소 면역 분석법 (ELISA) 4,5 기반으로했다. 초점과 플라크 감소에 따라 MN 분석 1990 년 6,7,8 개발되었다. 플라크 감소 분석은 감염을 정량화 볼 수 플라크를 계산에 의존하고 있습니다. 그러나, 시각 카운트는 플라크의 대부분이 작은 많은 현재의 순환 바이러스에 대한 눈에 보이지는 않지만 인간의 눈으로 확인할 수있는 큰 플라크를 다룹니다. 이 불완전한 정보에 따르면 내가 선도, 심사관들과 실험 사이에 상당한 변화를 일으킬 수 있습니다ncomparable 결과. 또한 일부 바이러스는 단일 세포 또는 매우 작은 플라크 불현성 감염을 표시 할 때 방법을 사용하는 것도 불가능하다.
가난한 계수 해상도 이미징 기반 프로토콜을 도입함으로써 개선 될 수있다. 기술, 광학 현미경 및 높은 처리량의 발전과 함께 잘 플레이트 리더는 감염된 세포 구를 계산하는 정확한 방법을 제공 할 수 있습니다. 트랜스 조명 현미경, 특정 마커 태그 감염된 세포는 서브 세포 해상도에서의 흡수 또는 형광 대조적으로 시각화 할 수있다. 시료 후 컴퓨터 화면에서 분석 될 수있다.
불행히도 인해 시야의 제한으로 100 개 이상의 타일 이미지는 하나의 웰을 포함해야한다. 96 웰 플레이트로 분석하면 약 만 화상의 화상 처리를 필요로한다. 이러한 힘든 과정은 시간이 걸리고 비싸다하고 얻은 해상도는 장군에바이러스 감염의 일상적인 특성에 대한 불필요한 리터. 제한된 예산 연구소는 평판 스캐너 중심으로 구축 접근 방식은 비용 효과, 높은 처리량 대안을 제공하는 것을 알 수 있습니다.
본 논문에서는 바이러스의 많은 수의 항원 특성에 대한 정량적 항 바이러스 활동 및 중화 항체를 측정하기에 적합한 개선 된 플라크 감소 MN 분석에 대해 설명합니다. 분석은 여러 가지 장점이있다 : 첫째, 상관없이 플라크 크기, 세포 수준에서 바이러스 감염을 측정 할 수있는 영상 기반 분석법이다. 잘 내 총 감염된 세포 집단 (ICP)를 계산하는 것은 대단히 가능한 낮은 감염으로 바이러스를 특성화 할 수있게, 검출 감도를 증가시킨다. 둘째,보다 정확한 정량 적정 입력 된 바이러스의 양을 결정하기 위해 중화하기 전에 도입된다. 정량적 입력 바이러스는 상당히 감소 바리다른 실험 사이 기는 실험실의 결과는 더 비교할 수 있습니다. 셋째, 중화 역가를 이미지 분석을 빠르게 정량을 사용자 친화적하여 결정될 수있다. 마지막으로, 프로토콜은 필요한 해상도와 정확도를 비용 효율적이고 높은 쓰루풋의 대안을 제공한다. 정량은 평판 스캐너 무료 데이터 처리 소프트웨어를 기반으로합니다. 전체 설치는 작은 풋 프린트를 가지고 있으며, 대부분의 실험실에서 배포합니다.
이 논문에 제시된 프로토콜은 바이러스 적정, 적정 정량, 바이러스 중화, 중화 정량 등 4 개 주요 단계로 구성되어 있습니다. 바이러스 적정 입력 된 바이러스의 양이 중화에 사용하는 결정 제제 실험이다. 적정 기간 동안, 바이러스 농도의 숫자가 96 웰 플레이트에서 세포 단층에 적용된다. 감염된 세포는 다음 섹션 2. 바이러스 dilu에 정량된다20 %에게 -85 %를 생산 능은 ICP 차례에 대응하는 중화에 입력 바이러스와 같은 적용 섹션 3. 중화 프로토콜의 역가가 섹션을 위의 프로토콜이 대표 결과에 제시되어 다음 4. 실험을 사용하여 정량한다. 분석은 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 형 바이러스와 같은 현재의 순환 인플루엔자 바이러스의 대부분과 함께 지난 2 년 동안 철저하게 테스트되었습니다. 인플루엔자 바이러스의 특성 분석의 결과는 2016 년 남반구와 2016에서 2017 사이에 북반구에 사용되는 인플루엔자 백신에 대한 권장 사항을 준 WHO 상담 회의의 보고서에 포함되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 바이러스 항원 간의 실제 관계를 정량화하는 촬상 계 MN 분석을 설명했다. 다른 플라크 감소 분석과 비교하면,이 방법은 감염 인구의 완전한 커버리지를 보장 전체 웰의 ICP 측정 강조한다. 플라크 형성의 독립성은 주로 보이지 않는 작은 플라크를 형성 할 수 있거나 단지 하나의 세포 감염을 관리 할 수있는 바이러스 분석의 어플리케이션을 넓힌다. 따라서, 분석은 더욱 바이러스 및 HI 항체가보다 넓은 범위의 효과를 조사 할 수 있고, 이는 더 포괄적 유사성 또는 바이러스 항원 (12) 사이의 차이를 반영하도록 돕는다. 예를 들어, 오셀 카르 복실 레이트가 포함하면, MN의 분석은 이하 더 정확하게 항원 차이를 반영 결합 NA 의존성에 의해 영향을 받는다. 분석의 개발 과정에서 많은 노력 실험 일관성, 속도 및 검출을 향상시키기 위해 이루어졌다감도 평판 스캐너 높은 처리량 정량화 적정 이미징을 통해 입력 된 바이러스를 제어하는 것을 포함하고, 사용자 친화적 인 데이터 프로세싱 플랫폼을 구현. 결과는 일반적으로 일치 있었고, HI의 사람들을 확인했다. 특히,이 결과는 또한 특정 A (H1N1) pdm09 바이러스 HA1에 G155E 교체 등 배양 선택하거나 산발적 변화에 의한 최근 A 형 및 B 백신 바이러스 항원 드리프트 변종 간의 항원 차이뿐만 아니라, 항원 성 변화를 보여 12.
프로토콜은 크게 영상 신호를 강화 강한 감염 준 세포주의 선택과 바이러스 타입 또는 서브 타입을 매칭. 실험적 변이를 시험 항혈청의 개수와 균형 중복 설계 평활화 하였다. 불확실성은 주로 화상 형성 장치에 의해 영향을 받는다 화질로부터 올 수있다. 점잖은 컬러 플랫 베드 스캐너는 유의 수ficantly 이미지 대비를 개선하고 소음을 줄일 수 있습니다. 바이러스가 계속 동일한 상태를 유지하면서 중화에 입력 된 바이러스의 양을 정량적으로 대응하는 적정에서 미리 결정되어야한다. 중화하는 동안 감염에 대한 항혈청 반응의 기준 바이러스 (VC)과 배경 레벨 (CC)의 차이점에 대해 정규화된다. VC 및 CC의 정확한 측정은 중화 실험에 필수적이다. 더 많은 중복 (팔 중복이 대표 결과에 사용 된)을 권장합니다. 마지막으로, 소프트웨어를 이해하는 것이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 이 소프트웨어는 2 년 이상에 대한 WHO 인플루엔자 센터, 영국에서 일상적인 바이러스 특성에 대해 테스트되었습니다. 다양한 상황 처리에 대한 자세한 설명은 보충 S1에 제공됩니다.
MN이 분석은 시료가 EXT 커버 용도에 적합remely 큰 시야 만은 적당한 이미지 해상도를 필요로한다. 낮은 비용과 간단한 설치는 대부분의 바이러스학 실험실에 시스템을 쉽게 사용할 수 있도록. 동일한 시료의 측정치의 변화는 대략 11 스캔 중에 도입 된 불확실성을 정의 3 % 미만이었다. 이러한 재현성 많은 바이러스 학적 연구에 충분하며, 상기 복수의 스캔 이미지를 평균함으로써 감소 될 수있다.
결론적으로, 본 연구는 통상적으로 항원 성 연구에 사용될 수 있으며, 특히 인간의 인플루엔자 백신에 포함 바이러스 반기 선택할 인플루엔자 바이러스를 현재 순환의 상세한 분석의 HI 데이터를 지원하는 강력한 MN 분석을 보여준다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
Referencias
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