Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay
Summary
Deze studie beschrijft een -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Micro-neutralisatie (MN) assays worden in virologie voor de kwantificering van neutraliserende antilichamen en antivirale activiteiten. In plaats van hemagglutinatie inhibitie (HI) assays, MN assays kunnen niet- antigenisch effecten beïnvloed door de veranderingen van receptor-bindende affiniteit van influenzavirussen, die kunnen bemoeilijken de interpretatie van resultaten HI 1,2,3 overwinnen. Tot voor kort waren de meeste MN assays gebaseerd op cytopathische effecten (CPE) of enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN assays op basis van focus en plaquereductie werden ontwikkeld in 1990 6,7,8. Plaquevermindering assays vertrouwen op te tellen zichtbaar plaques om het besmettingsgevaar te kwantificeren. Echter, visuele telt alleen betrekking grote plaques die oplosbaar door menselijke ogen, hoewel de meeste plaques zijn klein en onzichtbaar voor vele huidige circulerende virussen. Dit onvolledige dekking kan aanzienlijke verschillen veroorzaken tussen examinatoren en tussen de experimenten, wat leidt tot incomparable resultaten. Het is ook mogelijk de werkwijze te gebruiken bij sommige virussen vertonen abortieve infectie van enkele cellen of zeer kleine plaques.
De arme telresolutie kan worden verbeterd door de introductie van een imaging-gebaseerd protocol. Met de vooruitgang in technologie, optische microscopie en high-throughput kan goed-plaat lezers accurate manier om de geïnfecteerde cellen 9 tellen bieden. Onder een trans-verlichte microscoop, kunnen geïnfecteerde cellen gelabeld met bepaalde markers worden gevisualiseerd door de absorptie of fluorescentie contrast in sub-cellulaire resolutie. Een monster kan vervolgens worden geanalyseerd op een computerscherm.
Helaas, vanwege de beperking van het gezichtsveld, meer dan honderd beeldvensters dienen een enkel putje bedekken. Het analyseren van een plaat met 96 wells zou de beeldvorming en de verwerking van ongeveer tienduizend beelden nodig. Dergelijke moeizaam proces is tijdrovend en duur, en de resolutie is opgedaan general onnodig voor routine karakterisering van virale infecties. Laboratoria met een beperkt budget kan vinden dat de aanpak rond een flatbedscanner biedt een kosteneffectieve, high-throughput alternatief.
In dit artikel beschrijven we een verbeterd plaquereductie MN test die geschikt is voor het karakteriseren van antigene een groot aantal virussen en voor het kwantitatief meten antivirale activiteiten en neutralisatie antilichamen. De test heeft een aantal voordelen: ten eerste een imaging-gebaseerde test die kan virusinfecties maatregel op cellulair niveau, ongeacht de plaque grootte. Het tellen van de totale geïnfecteerde celpopulatie (ICP) in een put verhoogt de detectiegevoeligheid, waardoor het mogelijk om de virussen te karakteriseren met lage infectiviteit. Ten tweede wordt een meer accurate kwantitatieve titratie vóór neutralisatie geïntroduceerd om de hoeveelheid toegevoegd virus te bepalen. De kwantitatieve ingang virus vermindert de variatie tussen de verschillende experimenten en maakt de resultaten beter vergelijkbaar tussen laboratoria. Ten derde neutralisatie titers kunnen rechtstreeks door het analyseren beelden, waardoor de kwantificering snelle en gebruikersvriendelijke bepaald. Tenslotte het protocol levert een rendabele hoge-doorvoer alternatief met de vereiste resolutie en nauwkeurigheid. De kwantificering is gebaseerd op een flatbed scanner en vrije data processing software. De hele opzet heeft een kleine footprint en is inzetbaar in de meeste laboratoria.
Het protocol in dit document bestaat uit vier belangrijke stappen, met inbegrip van virus titratie titratie kwantificering, virus neutraliseren, en neutralisatie kwantificering. Virustitratie is samengesteld experiment dat bepaalt de hoeveelheid invoer virussen voor gebruik in neutraliseren. Tijdens een titratie, een aantal virale concentraties worden toegepast op de celmonolagen in 96-wells plaat. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gekwantificeerd in deel 2. De viral Dilutie die 20% -85% ICP produceert op zijn beurt toegepast als input virussen de overeenkomstige neutralisatie in sectie 3. De titers van de neutralisatie protocol worden gekwantificeerd met behulp van sectie 4. Experimenten die volgden de bovenstaande protocollen worden gepresenteerd in de Representatieve resultaten. De assay is uitgebreid getest gedurende de afgelopen twee jaar met de meeste van de huidige circulerende influenzavirussen zoals A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B virussen. De resultaten van het influenzavirus karakterisering werden opgenomen in de verslagen van de WHO overleg dat de aanbevelingen over griepvaccins voor gebruik in het zuidelijk halfrond in 2016 en het noordelijk halfrond in 2016-2017 gaf.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschrijven we een imaging-gebaseerde MN test de werkelijke antigene relatie tussen virussen kwantificeren. In vergelijking met andere plaque-reductie assays, benadrukt de methode het meten van de ICP van een heel goed, het waarborgen van de volledige dekking van de infectieuze bevolking. De onafhankelijkheid van plaquevorming vergroot tevens de toepassing van de bepaling voor virussen die hoofdzakelijk onzichtbaar kleine plaques kan vormen of die slechts beheerder eencellige infectie. Aldus was de zuiverheid kan onderzoeken vermenigvuldigen en de effecten van een groter aantal antilichamen dan HI, en het helpt om uitgebreider weerspiegelen de antigene overeenkomsten of verschillen tussen virussen 12. Wanneer bijvoorbeeld oseltamivircarboxylaat is opgenomen, de MN test wordt minder beïnvloed door NA-afhankelijke binding, die de antigene verschillen nauwkeuriger. Tijdens de ontwikkeling van de test werden grote inspanningen geleverd om het experiment consistentie, snelheid en detectie verbeterengevoeligheid, onder meer door het beheersen ingang virussen door middel gekwantificeerd titratie, beeldvorming in high throughput met een flatbed scanner, en implementeren van een gebruiksvriendelijke data processing platform. De resultaten zijn over het algemeen in overeenstemming met geweest en bevestigde die van HI. Met name de resultaten bleek ook antigene verschillen tussen antigene drift varianten recente type A en B vaccin virussen en antigene veranderingen veroorzaakt door kweek geselecteerde of incidenteel veranderingen, zoals G155E vervanging HA1 bepaalde A (H1N1) pdm09 virussen 12.
Het protocol paste het virustype of subtype met de selectie van cellijnen die de sterkste infectie, die de beeldvorming sterk verbeterd signaal gaf. Experimentele variant werd glad gemaakt met het ontwerp van duplicaten dat evenwicht met het aantal geteste antisera. Onzekerheden komen ook de beeldkwaliteit, die voornamelijk wordt beïnvloed door de beeldvormingsinrichting. Een fatsoenlijke kleur flatbed scanner kan Significantly verbetering van het imago contrast en het lawaai te verminderen. De hoeveelheid toegevoegd virus in de neutralisatie, kwantitatief worden bepaald tevoren in de overeenkomstige titratie terwijl de virussen niettemin van hetzelfde te behouden. Tijdens neutralisatie, het antiserum reactie op een infectie wordt genormaliseerd tegen het verschil tussen de referentie-virus (VC) en het achtergrondniveau (CC). Nauwkeurige metingen van VC en CC zijn essentieel voor een neutralisatie experiment. Meer duplicaten aanbevolen (acht duplo werden in de Representatieve resultaten). Tenslotte begrijpen van de software is essentieel voor het succes van een experiment. De software is getest op routine virus karakterisering van de WHO Influenza Centrum, het UK voor meer dan twee jaar. Gedetailleerde instructies voor het omgaan met verschillende situaties is voorzien in het aanvullend S1.
Dit MN test is geschikt voor toepassingen waar de monsters beslaan een extremely groot gezichtsveld, maar vereisen slechts een matige beeldvorming resolutie. De lage kosten en eenvoudige setup maken het systeem gemakkelijk beschikbaar voor de meeste virologie laboratoria. De variatie in de metingen van hetzelfde monster minder dan 3%, wat ruwweg de onzekerheid die tijdens het scannen 11 definieert. Dergelijke reproduceerbaarheid volstaat vele virologische studies en kan verder worden gereduceerd door het middelen beelden van meerdere scans.
Samenvattend toont dit onderzoek aan een robuust MN test die routinematig worden gebruikt in antigene studie en HI data in gedetailleerde analyses van momenteel circulerende influenzavirussen, met name voor de halfjaarlijkse selectie van virussen voor opname in humane influenza vaccins.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
Referencias
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
