Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

De hersenen staat bekend om de diversiteit in de structurele en functionele kenmerken van de individuele neuronale elementen. Inzicht in de rollen van verschillende neuronale types in de hersenfunctie en pathologie vereist karakterisering en ondubbelzinnige identificatie van neuronen. Structureel, de morfologische kenmerken gedefinieerd door somato-dendritische locatie te bepalen de mogelijke ingangen die een bepaalde neuron ontvangt, terwijl het patroon van axonale arborization identificeert potentiële postsynaptische targets. De structurele diversiteit van neuronen is gewaardeerd sinds de dagen van Ramón y Cajal's rudimentaire histologische studies ^1. De komst van single-cell opnametechnieken bleek dat structureel verschillende neuronen verschillen in afvuren patronen en synaptische kenmerken tonen ook. De diversiteit in de structuur en fysiologie is vooral duidelijk in GABAergic remmende neuronen ^2,3. Bovendien, is het steeds duidelijker geworden dat structurally vergelijkbaar neuronen kunnen verschillende neurochemische merkers en tonen overeenkomstige functionele ⁴ verschillen uit te drukken. Ook neuronen met dezelfde neurochemische merkers kunnen verschillende structuren en functies ^5-10 hebben. Dus in de praktijk, de analyse van de functionele eigenschappen van neuronen en hun rol in het netwerk vereist de definitie zowel de morfologische en neurochemische identiteiten. Zelfs met de komst van reporter muizenlijnen gericht op specifieke neurochemische markers, is het vaak noodzakelijk om de morfologie en subtype identiteit bepalen op basis van immunohistochemische ^11.

De standaard methode gebruikt om cellen die in acute hersenen plakjes te karakteriseren is om ze te vullen met biocytine of neurobiotin tijdens de opname, de secties in paraformaldehyde (PFA) na de opnames vast te stellen, en het gebruik van immunohistochemie om de morfologie en neurochemie onthullen. Aangezien de dikte van de punten voor segment fysiologie typisch 300 urnof meer, en omdat de meeste antilichamen niet helemaal doordringen die diepte, moeten de segmenten opnieuw worden coupes te 60 micrometer om gelijktijdige immunokleuring voor biocytine en neurochemische merkers ^12-14. Helaas, resectioning is bewerkelijk; riskeert het verlies van weefsel tijdens het snijden; en kan leiden tot differentiële weefsel krimp, complicerende morfologische reconstructies. Bovendien kan de voorkennis van de morfologie helpen beperken de kandidaat markers die waarschijnlijk door de cellen tot expressie te brengen zijn. We hebben de standaard biocytine immunohistologie protocollen aangepast om seriële verwerking van afdelingen mogelijk eerst voor het herstel van de morfologie en vervolgens voor de identificatie van mogelijke neurochemische markers.

Immunohistochemie is de studie van antigeen verdeling in weefsels en cellen en kan worden gevisualiseerd met behulp van een enzym, fluorescerende labels, radioactieve elementen of colloïdaal goud partikels ^15. De procedure involves behulp primaire antilichamen specifiek amplificeren label en één of meer antigenen, gevolgd door het gebruik van fluorescente secundaire antilichamen gericht op het primaire antilichaam voor visualisatie. Vanwege de noodzaak om de fluorescentie spectra van elke secundaire antilichaam onderscheiden zonder overlap, kan slechts een beperkt aantal antigenen gelijktijdig worden onderzocht. Aldus kan voorkennis morfologie bruikbaar zijn bij het selecteren van de gegadigde neurochemische merkers voor cellulaire indeling zijn. Conceptueel is de ratio seriële verwerking van al-gekleurde coupes gebaseerd op de vooronderstelling dat immunokleuring voor één eiwit of peptide raakt niet aan antigeniciteit en daaropvolgende immunokleuring voor een structureel onafhankelijk peptide ^16. Dit gebrek aan interferentie wordt veroorzaakt door de binding van de antilichamen tegen een specifiek eiwit epitoop op een antigeen en derhalve voorziet in de gelijktijdige kleuring van meerdere antigenen in hetzelfde weefsel. Het aantal antigenen revealed door immunokleuring wordt beperkt door de behoefte aan niet-overlappende spectra van fluorescente secundaire antilichamen en door de noodzaak om individuele antigenen met antilichamen opgewekt bij diverse soorten richten teneinde elimineren kruisreactiviteit ^17,18. Hoewel dit de redenering achter seriële plaats gelijktijdige labeling met twee verschillende antilichamen die kunnen interageren, voorzover ons bekend, immunokleuring voor een tweede antigeen is niet gemeld na voltooiing van immunokleuring voor één of meer antigenen op gemonteerde profielen. Hier beschrijven we een werkwijze voor seriële immunokleuring van eerder bevlekt en gemonteerde profielen. Hoewel we detail het proces voor een seriële immunokleuring procedure voor het terugwinnen van morfologie, gevolgd door kleuring op eiwit / peptide markers in dikke gedeelten kunnen dezelfde procedures worden gebruikt in standaard, dunne coupes ook. Daarnaast beschrijven we een praktische benadering opgenomen neuronen met biocytine en het proces om het los te vullenelektrode van de cel na voltooiing van opnames voor het vullen van de axonale en dendritische assen van neuronen te optimaliseren, zoals beschreven in onze recente werk ^6,8.

Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven werkwijze is dat de morfologie van de cel opgenomen kan volledig worden hersteld en afgebeeld alvorens resectie of immunostain de segmenten. Hoewel problemen met de penetratie van bepaalde antilichamen het noodzakelijk om resectie plakken voor secundaire immunokleuring kunnen maken, zouden de procedures hier beschreven de noodzaak om complexe neuronen van meerdere secties te reconstrueren uitschakelen, zodat problemen als gevolg van weefsel verlies en differentiële krimp te vermijden, die de wederopbouw in gevaar kunnen brengen volgende resectioning. Een bijkomend voordeel is dat het proces kosten, tijd, inspanning en dure antilichamen zullen beperken doordat immunokleuring en opnieuw snijden plakjes waarin biocytine-gevulde neuronen worden teruggewonnen. De meest praktische aspect is de advertentiemende immunokleuring die kunnen worden uitgevoerd op secties gekleurd maanden voordat de bovengenoemde techniek. Met name zou het herstel van de morfologie aanzienlijk het potentieel dat fysiologische gegevens uit de cellen wordt verwijderd als gevolg van een onvermogen om een ​​fundamentele morfologische karakterisering van het celtype te verkrijgen te verminderen.