Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

La tecnología de hibridomas se presenta en este protocolo fue descrito por primera vez por Köhler y Milstein ¹ en 1975 y, a excepción de algunas mejoras técnicas, el procedimiento principal no ha cambiado drásticamente durante los últimos 40 años ^2. El objetivo de este protocolo es para explicar una estrategia más apropiada inmunización, un método estándar para la generación de anticuerpos monoclonales, y un ejemplo de un método de validación (ELISA).

Los anticuerpos son herramientas increíbles y contribuyen a una amplia gama de enfoques tecnológicos, tales como citometría de flujo, clasificación de células magnético, o de inmunofluorescencia, así como a las opciones diagnósticas y terapéuticas para el seguimiento y tratamiento ³ enfermedad. La disponibilidad comercial de anticuerpos monoclonales para los objetivos deseados se demuestra por la presencia de más de 24 diferentes bases de datos web con casi innumerables cantidades de anticuerpos o productos relacionados con anticuerpos ^4. En 2015, unantibody moléculas eran parte de una discusión internacional ^5-7 debido a serios problemas en la validación y caracterización de anticuerpos disponibles comercialmente correcta.

Puede ser difícil y costoso para encontrar anticuerpos específicos para un antígeno específico, y, a menudo, no tienen la afinidad o especificidad necesaria. A pesar de generar un anticuerpo es todavía mucho tiempo y requiere de personal capacitado para desarrollar y validar el anticuerpo, que produce un anticuerpo individualmente puedan mejor que comprar uno.

Debido al hecho de que la producción de anticuerpos es mucho tiempo y requiere experiencia, se han desarrollado métodos alternativos para la producción de moléculas de unión para superar estos problemas. El método alternativo más comúnmente utilizada es la producción recombinante de anticuerpos de cadena única a través de presentación en fagos. Los genes de la región variable de unión se extraen de las células y se combinan con la proteína de revestimiento de un fago. los scadena ingle se expresa entonces en la superficie de un bacteriófago y se tamiza en varios pasos paneo ^8. La producción de anticuerpos de cadena única es un poco más rápido, pero también requiere un experimentador experto. Las desventajas de algunos anticuerpos de cadena simple recombinantes son una mala estabilidad y una falta de idoneidad para el diagnóstico in vitro. En la mayoría de las pruebas de diagnóstico, un Fc-receptor para la detección es necesario, que debe ser añadido a un anticuerpo de cadena sencilla recombinante después. De nuevo, esto es mucho tiempo y es aún más compleja que la técnica de hibridoma. En el diagnóstico in vitro, los anticuerpos monoclonales de ratón de longitud completa y de conejo se han demostrado ser la mejor opción.

Uno de los pasos más importantes en la generación de anticuerpos monoclonales se debe hacer antes de que el trabajo en el laboratorio a partir: el diseño del inmunoconjugado. Las preguntas que deben abordarse son: ¿Cuál es la composición física del objetivo en el último applicationes, y cuyas matrices están presentes? Cuya concentración será el objetivo de tener en la aplicación? ¿Cuál es la aplicación final, y cuáles son los requisitos que debe cumplir el anticuerpo?

Siempre tener en cuenta que si se utiliza un fragmento de péptido lineal, sino que también tiene que ser lineal en el epítopo final en la diana de elección; de lo contrario, el anticuerpo no se unirá. Por supuesto, independiente del método de selección, los anticuerpos podrían ser seleccionados para reconocer diferentes formatos antigénicos en diferentes aplicaciones, pero esto deben ser validados con mucha precisión. Estas son las razones por las cuales el desarrollo de anticuerpos y la validación son tales procesos ambiciosos.

La elección del formato antigénico para la inmunización es fundamental para el desarrollo de anticuerpos y determina el éxito o el fracaso de este proceso. Una vez que los ratones expresan un título de anticuerpos relevantes, se aíslan las células del bazo y se fusionan con células de mieloma. Las líneas celulares de mieloma más comunes parael desarrollo de anticuerpos monoclonales murinos son X63-Ag 8.653 ⁹ y Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ de un / c cepa de ratón Balb. Las células descienden de un linfoma de células B malignas y se seleccionaron debido a que no secretan cualquiera de sus propias cadenas pesadas o ligeras. Las células pueden adaptarse a una relación de entre 1:10 y 10: 1 (esplenocitos frente a las células de mieloma). En este protocolo, las células se adaptan a una proporción de 3: 1 y se fusionan por polietilenglicol (PEG) y electrofusión, de acuerdo con Stoicheva y Hui ^11.

La fusión de las células B y las células de mieloma es un proceso aleatorio. Por lo tanto, los híbridos de dos B linfocitos o dos células de mieloma se podrían generar, pero los híbridos que no serían capaces de sobrevivir durante un largo tiempo en cultivo. Las células se someten a una selección de hipoxantina, aminopterina, y timidina (HAT), mediante el cual sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir debido a la posibilidad de utilizar la vía de novo de la síntesis de pirimidina. Para la generación de lunoclonal anticuerpos, es necesario obtener una línea celular procedente de una célula madre. El monoclonalidad se garantiza mediante la limitación de las técnicas de dilución y el análisis microscópico de crecimiento celular. Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se criban para la producción de anticuerpos específicos, principalmente por ELISA o citometría de flujo, y los mejores aglutinantes se seleccionan. Después de la cultura de masas y la purificación, la molécula de anticuerpo, finalmente, se puede caracterizar y validado para la aplicación deseada.