Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Die Hybridom – Technologie in diesem Protokoll vorgestellt wurde zuerst von Köhler und Milstein ¹ 1975 beschrieben und mit Ausnahme von einigen technischen Verbesserungen hat die Hauptprozedur nicht dramatisch während der letzten 40 Jahre ² geändert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine geeignetere Immunisierungsstrategie, eine Standardmethode zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, und ein Beispiel für eine Validierungsmethode (ELISA) zu erklären.

Antikörper sind unglaubliche Werkzeuge und tragen zu einer breiten Palette von technologischen Ansätzen, wie Durchflusszytometrie, magnetische Zellsortierung oder Immun sowie zu diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für die Überwachung der Krankheiten und Behandlung ^3. Die kommerzielle Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern für die gewünschten Ziele wird durch die Anwesenheit von mehr als 24 verschiedenen Web – Datenbanken mit fast unzähligen Mengen von Antikörpern oder Antikörper-verwandte Produkte ⁴ gezeigt. Im Jahr 2015 einntibody Moleküle waren Teil einer internationalen Diskussion ^5-7 aufgrund schwerwiegender Probleme in der richtigen Validierung und Charakterisierung von im Handel erhältlichen Antikörpern.

Es kann schwierig und teuer sein, um spezifische Antikörper für eine gezielte Antigen zu finden, und oft haben sie nicht die Affinität oder Spezifität benötigt. Obwohl einen Antikörper zu erzeugen ist immer noch zeitaufwendig und erfordert qualifiziertes Personal um den Antikörper zu entwickeln und zu validieren, einen Antikörper einzeln produzieren könnte besser als ein Kauf.

Aufgrund der Tatsache, dass die Antikörperproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Erfahrung, alternative Verfahren zur Herstellung von Bindungsmolekülen wurden entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die am häufigsten verwendete alternative Methode ist die rekombinante Herstellung von einkettigen Antikörpern mittels Phagen-Display. Die Gene für die variable Bindungsregion aus Zellen und in Kombination mit dem Beschichtungsprotein eines Phagen extrahiert. Die single Kette wird dann auf der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert und in mehreren Schritten Panning ⁸ gescreent. Die Herstellung von Einzelketten-Antikörper ist ein bisschen schneller, aber es erfordert auch ein erfahrener Experimentator. Die Nachteile einiger rekombinanter Einketten-Antikörper sind schlechte Stabilität und fehlende Eignung für die in vitro Diagnostik. In den meisten diagnostischen Tests, ein Fc-Rezeptor für die Detektion erforderlich ist, die anschließend zu einem rekombinanten Einketten-Antikörper zugegeben werden muss. Auch dies ist zeitaufwendig und sogar noch komplexer ist als die Hybridom-Technik. In In – vitro – Diagnostik, wurden in voller Länge monoklonalen Maus und Kaninchen – Antikörper zeigte die beste Wahl zu sein.

Einer der wichtigsten Schritte in der Herstellung monoklonaler Antikörper erzeugen, muss getan werden, bevor die Arbeit im Labor beginnt: das Design der Immunkonjugat. Fragen, die gelöst werden müssen, sind: Was ist die physikalische Zusammensetzung des Targets in der letzten applicat istIon, und die Matrizen vorhanden sind? Welche Konzentration wird das Ziel in der Anwendung? Was ist die letzte Anwendung, und was sind die Voraussetzungen, dass der Antikörper erfüllen muss?

immer berücksichtigen, dass, wenn ein lineares Peptidfragment verwendet wird, ist es auch in der endgültigen Epitop in der Zielwahl linear zu sein hat; andernfalls, binden die Antikörper nicht. Natürlich unabhängig von der Durchmusterungsverfahren, unterschiedliche antigenische Formate in verschiedenen Anwendungen zu erkennen Antikörper könnten ausgewählt werden, aber dies muss sehr genau überprüft werden. Dies sind die Gründe, warum der Antikörperentwicklung und Validierung sind solche ehrgeizigen Prozesse.

Die Wahl des Antigen-Format für die Immunisierung ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von Antikörpern und bestimmt den Erfolg oder das Scheitern dieses Prozesses. Nachdem die Mäuse einen entsprechenden Antikörpertiter exprimieren, werden die Milzzellen isoliert und mit Myelomzellen fusioniert. Die am häufigsten verwendeten Myelom-Zelllinienmurinen monoklonalen Antikörper Entwicklung sind X63-Ag 8.653 ⁹ und Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ von einer Balb / c – Maus – Stamm. Die Zellen stammen von einem bösartigen B-Zell-Lymphom und wurden ausgewählt, weil sie alle ihre eigenen schweren oder leichten Ketten nicht absondern. 1 (Splenozyten gegen Myelomzellen): Die Zellen können zwischen 1:10 und 10 bis zu einem Verhältnis angepasst werden. 1 und verschmolzenen durch Polyethylenglykol (PEG) und Elektrofusion , gemäß Stoicheva und Hui ^11: In diesem Protokoll wurden die Zellen in einem Verhältnis von 3 angepasst.

Die Fusion von B-Zellen und Myelomzellen ist ein Zufallsprozess. Daher Hybride von zwei B-Lymphozyten oder zwei Myelomzellen könnten erzeugt werden, aber diejenigen Hybride würde nicht für eine lange Zeit in Kultur überleben können. Die Zellen werden einer Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) Auswahl, nach dem nur fusionierten Hybridomzellen aufgrund der Möglichkeit der Verwendung der de novo – Weg der Pyrimidinsynthese überleben kann. Für die Erzeugung von monoclonal Antikörper ist es notwendig, eine Zelllinie Ursprung von einer Mutterzelle zu erhalten. Die Monoklonalität wird sichergestellt durch die Verdünnungstechniken begrenzen und die mikroskopische Analyse des Zellwachstums. Die Hybridom-Kulturüberstände werden auf spezifische Antikörperproduktion, meist durch ELISA gescreent oder Durchflusszytometrie, und die besten Bindemittel ausgewählt. Nach der Massenkultur und Reinigung kann schließlich das Antikörpermolekül charakterisiert und für die gewünschte Anwendung validiert werden.