תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em> Chlamydomonas reinhardtii</em
Summary
Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Abstract
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Introduction
אפיון פנוטיפי של אוספי מוטציה שיטתיים של אורגניזמים מודל הוא גישה מוכחת לנתח מורכבות הסלולר. Reinhardtii Chlamydomonas אצות הירוק unicellular הפלואידים יש קבוצת גן דמוי צמח, אבל זה התפצל מצמחי קרקע לפני כפילויות הגנום מרובות במפעל קרקע השושלת 2. באופן עקרוני, חוסר שכפול גנטי וכן מחזור החיים הפלואידים בעיקר מקלה מאוד הפסד של פונקציה גישות גנטיות. עם זאת, הפרעה במיקוד של גנים של עניין היא כמעט בלתי אפשרית בשל חוסר האינטגרציה גנומי הומולוגית יעילה. ספריית שיבוש insertional אקראית נמצאת בבנייה, בשילוב עם זיהוי המקום שבש, עד כה מניב סט ערוך של 1,935 שיבושים ממופים המייצגים 1,562 גנים 3. עם זאת, גישה זו (צפויה בכלל לייצר מוטציות null) אינה חל על גנים חיוניים. טמפרטורה רגישה (TS) מוטציות ניתן recovereד בגנים חיוניים, ושיטות האחרונות לאפשר זיהוי יעיל של הגן הנבדק ואת הנגע סיבתי. ניתוח פנוטיפי בטמפרטורה גבוהה ולאחר מכן מספק מידע מיידי על הפונקציה של הגן הנבדק. דיווחנו על בידוד ואפיון של מוטציות קטלניות ts ב ~ 70 גנים חיוניים Chlamydomonas, המתמקדת בעיקר על גנים המעורבים התקדמות מחזור התא ולשלוט 1,4.
מסכי קטלני Ts להיות עמוד התווך של ניתוח גנטי מיקרואורגניזמים במשך עשרות שנים 5,6. באופן עקרוני, תכונה רצויה היא להתקרב "רוויה", כלומר כל הגנים המסוגלים מוטציה כדי TS קטלנית מזוהים לפחות מוטציה אחת, המאפשרים ניתוח מלא. עם זאת, בפועל, מספר גורמים להגביל את הגישה לרוויה. ראשית, בעוד שכמעט כל הגנים יכולים להיות מוטציה לאובדן פעילות בטמפרטורה גבוהה, את היעילות של התאוששות של מוטציות כאלה משתנית לאורך לפחותסדר גודל 7,8. לכן, מסך אקראי מתחיל להרים להיטים חוזרים ונשנים "מתניידים" הרבה לפני שמתקרבת רוויה. שנית, בעוד מוטציות TS בדרך כלל לגרום לירידה בתפקוד, יכולים להיות שהם לא nulls נכון בטמפרטורה מגבילה (ולהפך, הם לעתים קרובות לא מתפקדים במלואה בטמפרטורה מתירני). בעיה זו ניתן לטפל במידה מסוימת על ידי השוואת אללים מרובים; אם הם כולם חולקים פנוטיפ משותף, זה יותר עשוי לשקף את התוצאה של איון פשוט של הגן. אללים מרובים הם גם מאוד מועילים עבור זיהוי מולקולרי סופי של נגע סיבתי 1. עם זאת, הבעיה "הנוסע המתמיד" כלומר אללים מרובים בגנים פגעו רק לעתים נדירות יכולים להיות קשים להתאושש.
מסיבות אלה, שפתחנו צינור משופר לבודד phenotypically לאפיין מוטנטים ts. אספנו יותר מ -3,000 ts מוטציות עד כה, אניncluding כ -200 מוטציות מחזור חדשות תא המועמד. ניתוח מולקולרי פנוטיפי של האוסף הזה, שכבר כולל מוטציות סבירות ביותר או כל מסלולי התא חיוני, אמור לספק תובנה השערות חדשות בביולוגיה של תא צמח. חשוב לציין, צינור זה יכול להיות מיושם על כל מיקרואורגניזם שגדל על אגרת לבנות קולקציות ts מוטציה ביעילות.
הערה על ציוד: שני רובוטים חשובים מאוד עבור יעילות בהליך זה (בורר מושבה בורר שילוב העתק plater / דובדבן). קוטפים בדרך כלל יש סיכות מתכת. מושבות הרים מוחזקות אוויר בפינים אלה במשך תקופה מסוימת (שניות עד דקות, בהתאם לדגם). Chlamydomonas מת כ -20 שניות על סיכת מתכת באוויר. זה מגביל בחירת מודל עבור האורגניזם. בענייני דיוק. בורר המושבה שלנו הוא די מדויק; עם זאת, זה קצת אלים בפעולה שלו ויש לו כמה אפשרות צולבות זיהום מבוסס הספרים. הוא לא נעשה שימוש גבוהאה מצפיפות 384 (4.5 מ"מ ריווח מרכז-מרכז); בצפיפות זה, את הדיוק מקובל לחלוטין. ציפוי ההעתק / דובדבן הרובוט לקטוף (המצורף שונה המשמשים ליישומים אלה) הוא הרבה יותר איטי ב במסיק, אבל הוא מדויק מספיק עבור צפיפות 1,536 (6,144 הוא אתגר, אפילו עבור רובוט מדויק מאוד זה; הערכנו צפיפות זה, אך בחר שלא להשתמש בו בגלל הקשיים השונים). הרובוט לא יעבוד גם אם צלחות נטענות באופן לא אחיד, וכו. חשוב ספוט לבדוק כדי להיות בטוח את הדברים הנכונים קורים; כמובן, הרובוט יפעל ללא השגחה בכלל, כל ילך טוב אם כמה הצלחות הראשונות צדקו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצינור המתואר כאן לבידוד תשואה גבוהה של מוטציות קטלניות ts מבטיח כי ככל הנראה כל המסלולים הסלולר חיוניים של הגנום Chlamydomonas מיוצגים. שני השלבים הקריטיים ביותר עבור גבייה יעילה של גני מחזור התא פוטנציאליים לשם מניעת חוזרות "נוסע המתמיד" אללים הם: 1) ההגדרה קוהרנטית של מאפייני פנוטיפ מעצר מחזורי תא שלמים 2) assay השלמה במקביל נגד שכבר זיהה שאילתא גנים כדי להגדיל את האוסף עם אלה שזה עתה מבודד.
כאשר מסונכרן על ידי מחזורי אור כהה, Chlamydomonas גדל photosynthetically בשעות היום ועלייה גודל התא> 10x ללא כל חלוקה DNA שכפול או תא 13. כ חופף עם תחילת הלילה, תאים ואז עוברים מחזורים רבים של לסירוגין שכפול הדנ"א, מיטוזה, ואת חלוקת תא (איור 8). שכם תקין זהדואר מספק הבחנה טבעית בין הגנים הדרושים בעיקר עבור צמיחת תאי יושרת גנים הדרושים במיוחד עבור מחזור חלוקת תא. מצאנו כי 10-hr ונקודות הזמן של 20 שעות הם מאוד אינפורמטיבי עבור פנוטיפי מחוספס ראשוני לחתוך 1. השיעורים הרחבים של מוטציות קטלניות ts שנכיר כיום, בהתבסס על התמונות האלה (ראו SI ב Tulin וקרוס, 2014) 1, הם: Notch, פופקורן, עגול, קטן, בינוני, תמוגה מוקדם, מחזור מרובה (איור 8 ).
שלוש הקטגוריות הרלוונטיות ביותר אנו מתמקדים הם Notch, פופקורן, ועגול. פנוטיפים "Notch" ו- "פופקורן" הוצגו בעבר להיות מאפיין של התא ביותר במחזור ספציפי הנגעים (למשל, קינאז cyclin התלוי mitotic, מכונות שכפול הדנ"א, topoisomerase II) 1. הופעתו של אחד (Notch) או מרובה (פופקורן) מטוסים לכאורה של חלוקת תא מתחלה אבל לא מוצלחת היא morphol נוחמחוון ogical חניכת מחזור התא. מוטציות אלה מפגינים בדרך כלל מעט או ללא פגמי צמיחה, עם גידול בנפח תא דומה WT ב סימן 10 שעות. פנוטיפים Notch ופופקורן ניכרים ב -10 שעות ו מפותחים לגמרי (קשור לעתים קרובות עם תמוגה תא) ב -20 שעות. "עגולים" תאים לגדול בדומה WT אבל עם ייצור הרבה מופחת של מטוסי חטיבה מתחלים לכאורה, ובכך מניב גדול, עגול תאים נעצרו. מוטציות קודמות בקטגוריה זו נפלו למרכיבים של קידום anaphase המורכב 14 או הגנים הדרושים לתפקוד microtubule (קו-פקטורים מתקפל-טובולין, מורכבי טבעת טובולין גמא) 1. לפעמים מאוחר יותר, תאים אלה לעתים קרובות מפגינים תמוגה תא מובהק.
"קטן" ו "בינוניים" תאים לגדול או negligibly (קטן) או משמעותי פחות מ WT (בינוני). רבי המוטציות אלה שזוהו עד כה יש נגעים בגנים אשר הסברים מציעים תפקידי cellula הבסיסיתהליכי גדילה r (תרגום או biogenesis ממברנה). האפליה המיקרוסקופית העיקרית בין בינוני ועגול נשענת על כמות צמיחה ב 10 שעות (עגול: כמו WT; בינוני: מופחת). מאחר הקטגוריות הקטנות והבינוניות הן גדולות למדי וכנראה משקפות נגעים ב מגוון גדול של מסלולים סלולריים, אנחנו לא מנסים להרוות בקטגוריות אלה; עם זאת, אנחנו רוצים מולקולריים לזהות נציגי המעמד להבין פנוטיפים של אובדן במסלולים מגוונים. שתי קטגוריות נחקרה הם: 1) בתחילת שנות ה-lysing מוטציות שמאבדים שלמות (הפסד של צבע ירוק, אובדן refractility) על-פי ציון 10-hr, עם מעט עדויות של צמיחת תאים לפני ו -2) המחזורים מרובים. תאים מתרבים בדומה WT ב -10 ו -20 שעות, אם כי הם מפגינים חוסר יכולת להשלים לבצע ריבוי לטווח ארוך.
אנחנו בעיקר הם מאפיינים "חריץ", "פופקורן", ו "עגול" לכלול תאים עגולים קטנים ובינוניים, כמו גםכמו מוטציות דולפות כי חלוקות תא שלמות כמה. זהו בעיקר על מנת להבטיח כי תכונות בסיסיות של הסלולר, כגון צמיחת שלמות הממברנה, הם פונקציונליות ולהעשיר את ההסתברות עבור גנים הקשורים חלוקים. גישה זו נמצאת להיות יעיל באופן אמפירי; עם זאת, ייתכן שגן מחזור התא הוא pleiotropic ויש לו תפקידים נוספים קודם לכן ב- G1, לפני החלוקה בפועל. במקרים כאלה, אשר אנו מצפים להיות נדירים, הם החמיצו. באופן כללי יותר, אנו שואפים מעצר הומוגנית, אשר בהסתברות גבוהה הוא עקב מוטציה סיבתי אחד כי הוא חלבון מתפקד לחלוטין. עם זאת, מאותה הסיבה כמו שתוארו לעיל, ייתכנו נקודות מעצר כמה ולכן, גמישות מסוימת רצויה בבחירת מועמדים.
על מנת להעשיר את האוסף עם גנים שזוהו זה עתה, המועמדים שנבחרו assayed עבור השלמה. אנו דורשים ts- בבקרה חיובית (שאילתה מול מוטציה שאילתה) ו- TS + בבקרה שלילית (query נגד WT). מוטציות חדשות באותה קבוצת ההשלמה כמו השאילתה הן ts-. חברות באותה הקבוצה שלמה כמעט תמיד משקפות נגע מולקולרי באותו הגן (זה היה המקרה עבור כל גן כזה בדקנו). לכן, עבור "מתניידים," אמת מידה זו היא פסילה לאפיון נוסף. מוטאנטים שלא היו באותו קבוצות שלמות כמו השאילתות הנבדקות מועמדי גנים חדשים ומאופיינים עוד יותר על ידי ביואינפורמטיקה כלים ניסיוניים. מאוד התאוששות משתנה של ts- אללים לקבוצות השלמות שונות היא תופעה כי ידועה היא, ההשתנות גדולה במידה ניכרת מאשר רעש פואסון, בשל ההשתנות הפנימית הגדולה של ניוון כדי ts- בין גנים שונים. גורם יכול לכלול הבדלי thermolability מהותיים; בגדלי חלבון שונים; הנוכחות של חלבון כמו מונומר לעומת כמו גדול, התייצב מורכב; ו חמים מוטגנים. זה כמעט nuisa טהורNCE. עם זאת, תוצאה חיובית וכתוצאה מכך אחד היא כי הרשימה "הנוסע המתמיד" אינה ארוכה (עם רק כמה מטרות הכובשות ביותר של הרשימה), ולכן הבדיקות השלמות עתירת העבודה אינה משימה עצומה עד לשלבים המאוחרים של הפרויקט.
כגישה משלימה, ביצענו assay הצמדה. ב assay זה, progenies כפול עמיד נבחרים וכפופים לבחינת הפנוטיפ ts-. פנוטיפ ts- צפוי (וצפה) עבור מוטציות באותה קבוצת ההשלמה כמו השאילתה או מוטציות קשורות קשר הדוק. עבור כל הגנים שנבדקו, פרי בטן WT צפוי להופיע (TS + פנוטיפ) ב סבירות מסוימת תלויה המרחק הגנטי. אנו מעריכים כי ישנם כ -100 zygospores לכל הזדווגות במקומות אלה. בהנחת 100% יעילים meiotic, זה יביא כ -100 צאצאי פעמים עמידים לתרופות מן הקלטות העמידות לתרופות הצמודות (25% של צאצאי meiotic, ארבעה לכל המיוזה, בשל Mירושת endelian). זה יהיה גם במקרה של מוטציות ts-, שבו 25% של progenies יהיו כפולה-מוטציה, ו -25% יהיו WT אם מוטציות השאילתה ולבדוק אינן צמודות. לכן, מתוך הצאצאים פעמים עמידות לתרופות, 25% יהיו WT (סביב 25 תאים). זהו המקרה עבור מוטציות לא צמודות לחלוטין; עם זאת, הצמדה מתונה (בתוך ~ 20 סנטימטרים, כ -2 מגה, או 2% מהגנום 115) יפחית במידה רבה או במידה לחסל את אות TS +. במקרה של הצמדה של המוטציה נבדקה לקסטה האנטיביוטיה, TS + haploids כי הם פעמים עמידות לתרופות הן נוכח כמויות נמוכות מאוד. זה בא לידי ככישלון לכאורה להשתלב מחדש עם כל המוטציות הנבדקות, למרות משלים כל המוטציות נבדקות, תוצאה סוטה כי הוא בקלות ציין; במקרים כאלה, backcrossing יפתור את הבעיה.
הן ידעו קודם מניתוח רצף, אנו מצפים גני מחזור תא Chlamydomonas להיות סביב 500 גנים 2, אם כי מוst, אבל כנראה לא כולם, הם חיוניים. אנחנו יהיו להעריך את צורך סיבובי mutagenesis נוספים כמו מוטציות יותר נאספות ורמת העולה רוויה.
הליך זה נועד ייחודי לחקר תהליכים ביולוגיים חיוניים ואת הגנים והחלבונים לבצען. מתודולוגיות אחרות כדי לייצר הפרעות בגנים חיוניים קיימות (למשל, שינוי של אללים mutagenized באקראי 16, אללים עבדו תנאים 17, או אללים hypomorphic 18). עם זאת, כולם דורשים הומולוגי, אשר נדחקו בתוקף וגטטיבי Chlamydomonas. התקבצו, חזור palindromic קצר interspaced בקביעות (CRISPR) / מערכת Cas9 הוקם ככלי רב עוצמה עבור שינוי גנטי 19; עם זאת, היא עדיין לעבוד ביעילות Chlamydomonas 20. אנושות, כל השיטות האלה דורשים ידע מוקדם של היעד. זוהי מגבלה חמורהאם רוצים לקבל את האפשרות ללמוד משהו חדש! הגישה שלנו תניב מוטציות זיהוי גנים חיוניים, עצמאיים של כל ידע מוקדם. לכן, ברמה הנוכחית של הטכנולוגיה, בידוד של מוטציות אקראיות ts ואחריו זיהוי גנים על ידי רצף עמוק עשוי להיות שיטה יעילה ביותר של צובר כניסה מהירה לתוך ביולוגיה של התא של חיידקים בתוך superkingdom צמח.
זיהוי של מוטציות סיבתי (מקרב ~ 100 מקודדי רצף-שינוי מוטציות בכל שיבוט) הוא מעבר להיקף של מאמר זה. רצף עמוק של ברכות segregant bulked 1 הוא יעיל אך עתיר עבודה. אסטרטגית ברכת קומבינטורית לקביעה כל המוטציות מספר רב של זנים, לאחר רצף מספר קטן של ברכות, הוא מאוד עלות ועבודה אפקטיבית. אסטרטגיה חדשה עבור סידור segregant קומבינטורית bulked הוא בפיתוח, אשר יאפשר זיהוי של מוטציות סיבתי בעשרות מוטציות simultaneously בריצת רצף יחיד (בהכנה). שיפורים אלה חשובים מאוד על מנת לאפשר את הצעד זיהוי גנים קריטי לשמור על הקצב עם הצטברות מהירה מאוד של מוטציות כי מתאפשרת על ידי בהתאם לנוהל המתואר.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת הצלב עבור ייעוץ ודיון שימושי. עבודה זו נתמכה על ידי PHS 5RO1-GM078153 ועל ידי פרס עמית ג'וניור מן סימונס קרן למיכל Breker.
Materials
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
Referencias
- Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
- Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
- Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
- Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
- Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
- Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
- Harris, E. . The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).
- Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
- Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
- Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
- Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
- Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
- Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
- Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).
