开发和鉴定人的中性粒细胞源性巨噬细胞新型亚群<em>体外</em

该协议是根据赫尔辛基宣言批准由当地人权委员会及所有参与者签署了知情同意书。 1.中性粒细胞分离和培养Gφ发展注：应使用无菌组织级脂多糖（LPS） – 免费解决方案，在生物安全层流罩内进行的所有步骤。不添加抗生素，细胞因子或生长因子的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基。 使用无菌头皮静脉集年轻健康的成年人在获得至少40毫升的静脉血。抽血到含有乙二胺四乙酸K 3盐真空采血管（K 3 EDTA），轻轻混匀。保持血液在室温下。 隔离使用聚蔗糖两步连续密度梯度中性粒细胞在1.119和1.077克/毫升。使用前使至室温的解决方案。 注意：在离心分离，红血细胞（红细胞）由多聚蔗糖和沉积物迅速聚集。的单核细胞（单核细胞/淋巴细胞）在上部等离子体之间发现/多聚蔗糖-1,077接口，而嗜中性粒细胞中发现只是红细胞之上，在聚蔗糖-1,077 / 1119接口（ 见图2）。该方法允许来自同一个体的单核细胞和嗜中性粒细胞的同时分离。 图2：从全血中性粒细胞隔离。多聚蔗糖在1.077克/ ml的小心地层叠在聚蔗糖 – 1.119克/ ml的顶部，以形成一个不连续梯度。然后将稀释的全血层叠在聚蔗糖 – 1.077的顶部。将试管立即经受在700 xg离心离心分离30分钟，在室温下无制动。三个不同的频带指出。 （A）的单核细胞，（B）的多形核细胞（PMN），和（C）的红血细胞（RBC）在管的底部。 请点击此处查看该图的放大版本。 添加12毫升聚蔗糖-1119到50ml无菌聚丙烯离心管的底部。 仔细层12毫升聚蔗糖-1077到聚蔗糖-1119。 稀释10 – 19 ml完整血的24毫升血用离子自由磷酸盐缓冲盐水含有2％热灭活的胎牛血清（HI-FCS）的最终体积（PBS）中。仔细层24毫升稀释的全血的上管的上部梯度。 离心机在700×g离心，在室温下30分钟 – 无制动器（20 24℃）。 注意：离心在较低温度下可能会导致细胞聚集和恢复差。 小心地从离心分离机取出管withouŧ干扰梯度。两个遮光层应观察（A：单核细胞和B：PMN，在图2中描绘）。 吸并丢弃这层流体达0.5厘米以上层A.传输（或丢弃）细胞管标有“单核”。 吸并丢弃剩下的流体可达0.5厘米以上层B.从该层转移细胞到标有“PMN”一管。 从每两个梯度管池PMN并用含有2％的HI-FCS至30毫升的最终体积的PBS洗涤。离心12分钟，在200 XG，弃上清并丢弃。 摆脱污染红细胞（RBC），加3毫升低渗0.2％冰冷的无菌氯化钠，同时通过用1毫升无菌吸管尖轻轻拉伸进出重悬浮沉淀。保持在冰上30秒。 后30秒，通过加入3毫升无菌1.6％冰冷的NaCl到管恢复等渗。 到6毫升等渗盐水，加入6米预热（37℃）l的RPMI-1640培养基补充有2％的HI-FCS和离心机在250×g离心12分钟。弃去上清液。该PMN颗粒应清洁RBC污染。 注：如果RBC污染时，PMN颗粒出现微红。 如果某些污染RBC仍然存在，重复步骤9和10多次。 悬浮在4ml RPMI-1640添加有10％的HI-FCS细胞沉淀并计数细胞用台盼蓝排除，以确定其浓度和存活率。 浓度调整至1.25 – 1.5×10 6 PMN / ml的（取决于实验需要），和板1.0毫升/孔在24孔板中。 注：在人口粒细胞中性粒细胞的纯度总是超过95％，在五月的Grunewald，姬姆萨染色和光镜的评估。 播种后，放置在一个单元 湿润的5％CO 2培养箱在37℃。 轻轻吸的一半更换介质每3天培养基并加入新鲜RPMI-1640培养基的相同体积补充有10％的HI-FCS中。使用脂多糖自由溶液和化合物和低内毒素水平的HI-FCS（0.05毫微克/毫升或更小）。 注：温和介质变化是势在必行自Gφ，这在培养开发不牢固地附着于培养皿和剧烈洗涤也可以洗掉的显影单元。 PMN培养后第4天，这取决于血液供体 – Gφ的外观是在3明显。在培养7天后，当Gφ在尺寸上非常大的 – 大多数这里描述的分析和测定都6之间执行。应当注意的是，除了1 – 10纳克/ ml的LPS的RPMI-1640培养基没有影响Gφ发展中培养。 14 2.激光共聚焦显微镜从新鲜分离的嗜中性粒细胞制备细胞离心涂片16，并从7天开发Gφ培养（第1节准备）。 注：为了增加菜的各种分析Gφ的浓度，轻轻地取下媒体的一半。确保Gφ中未除去培养基通过在光学显微镜下检查介质进行检测。然后，集中吸管中剩余删除轻轻地粘附Gφ。离心介质为在200 xg离心10分钟，并且重悬沉淀在100 – 120微升培养基。 使用100 – 120微升包含每张幻灯片细胞的培养基中。从各处理制备重复或三次重复幻灯片。旋转在84×g的7分钟。 干纺出细胞，并固定，用4％多聚甲醛将细胞在室温下化学罩10分钟。洗3次，用PBS（约100微升每洗涤几秒钟）。对于细胞内染色，透化，用0.5％的Triton X-100的PBS细胞在室温下10分钟，并用PBS洗涤5次。 注：在所有阶段，使用适当的缓冲/解决方案VOLU我以覆盖载玻片上的细胞的周边。使用确定细胞外围疏水屏障笔。 注意：多聚甲醛是有毒的。避免与皮肤和眼睛接触。穿戴合适的个人防护装备。 块细胞在RPMI-1640培养基10％正常山羊血清，并在4ºC或在室温下进行40分钟孵育过夜。用PBS洗涤。 100稀释（〜100微升）：用单一抗体（AB）或在1小鼠和兔的初级抗体（ABS）的组合孵育。在4°C – （20小时18）孵育过夜。 注意：在此，包含小鼠单克隆ABS：抗-CD14，抗CD63，抗CD66b，抗CD1C，抗CD15和抗细胞色素b-245轻链（p22- PHOX识别）。兔多克隆绝对包括：抗CD68，抗CD36，抗LC3B，抗髓过氧化物酶，抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），以及抗NOX2 / gp91- PHOX腹肌。同种型对照包括纯化的小鼠IgG1和IgG2的，和兔IgG。 PreparÈ根据制造商的说明在ABS和使用适当的体积（约100μl），以覆盖所述电池的周边。 洗涤细胞并用1/400二抗的Cy2-CF（488A）缀合的山羊抗兔IgG（绿色）孵育/或Cy5的（CF 647）缀合的山羊抗小鼠IgG（红色），在室温下搅拌40分钟。 注：根据制造商的说明稀释，并准备腹肌。 在洗涤后，装入滑动带安装介质，含有4'，对核染色6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）中的一个降低，然后立即放置盖玻片。 通过使用荧光显微镜和计划的Apo 40X浸油物镜共焦激光扫描系统进行分析的幻灯片。制备的幻灯片之后执行于30分钟至2小时的分析或在4℃下保持过夜。 计算单元面积和使用成像软件（ 例如，图像J）的荧光强度。对于共定位，QUAntify使用曼德斯重叠系数（MOC）17软件。 注：只有具有MOC细胞> 0.6可以被认为是与显著共定位的细胞。 3.中性粒细胞的轮回跨内皮细胞：巨噬细胞IL-8的影响（Gφ）形成注：使用24孔渗透性细胞培养插入的电池轮回检测。 涂层用150微升纤连蛋白的插入物以50微克/ ml的浓度的上腔室，并保持在室温下30分钟。 添加到上腔室5×10 4将EA.hy926内皮细胞/孔，再悬浮于150微升配制Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（完全培养基）的。 注：确保内皮细胞单层汇合后使用。 到下腔室中，添加完全培养基的700微升。 将渗透细胞培养在簇托盘和培养将EA.hy926内皮细胞2天插入于37℃在5％CO 2。 注：在并行，第二天准备新鲜的中性粒细胞（如第1节）。 2天后，在该插入物的下部和上部腔室更换介质。 到下室中，添加补充有10％III-FCS和白细胞介素（IL）-8 RPMI-1640培养基在50纳米/ ml的终浓度。不要添加IL-8的控制下腔。 到每个上部室，在100μlRPMI-1640培养基的补充有10％H-FCS添加10 6新鲜的PMN。 孵育群集盘在37℃下在5％CO 2 90分钟。 90分钟孵化后，从上层的细胞和下腔分开并计数各亚群。在每个腔室的总细胞的百分比明示细胞加入。 注：小心地从上chamb除去细胞器通过以避免去除内皮细胞和转移到无菌管中轻轻吹打。通过移液并用500μl和转让下部腔洗涤到第二无菌管中删除从下室中的细胞。 如在步骤中指定池10 6个细胞从transmigrating（下室）和非迁移（上室）PMN馏分并培养每7天无生长因子的几个孔14 – 16（第1部分）。 旋转细胞在载玻片上16和第2条所描述的分析通过共聚焦显微镜各培养条件发达的细胞。