ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

プロトコル内のすべてのステップは、ブリストル大学の動物のケアの福祉ガイドラインや英国内務省のものに従ってください。 筋骨格解剖学の1可視化注：筋肉を定量化するために、筋肉の添付ファイルの正確な配置を識別するために、骨格要素の形状を可視化するために、免疫染色（セクション1.1）（筋肉を明らかにする）骨格筋ミオシンのための適切な年齢で魚やII型コラーゲン（可視化します軟骨）。筋肉の添付ファイル（1.2節）の位置を視覚化するために、GFP 15：軟骨と遅いミオシン重鎖レポーターsmyhcを可視化するためにmCherryを13,14：別の方法として、例えば、コラーゲンa1のレポーターCOL2A1トランスジェニック蛍光レポーターラインを使用して、筋骨格解剖学を視覚化します。 軟骨や筋肉をマーク代替行が等しく十分に仕事ができます。 蛍光Immunostaining 1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、過剰の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で幼虫を固定します。 0.1％のTween 20（PBT）を含むPBSで洗浄し、それぞれ5分間、PBT中の50％メタノール（MeOH）で100％MeOHに脱水。 注意：PFAは毒性があり、材料安全シートに従って処理する必要があります。 注：必要になるまで幼虫が100％MeOH中に格納することができます。 5分間PBTに50％MeOH中の幼虫を再水和。 5分間PBTで洗浄します。 5-6分間氷上でPBTで0.25％トリプシンで幼虫を透過性。 5分ごとに4倍PBTで洗います。 PBTの5％血清中で2-3時間ブロックします。 室温でまたは一晩4℃で1時間、PBT中の5％血清中のウサギ抗2型コラーゲンとマウスの推奨希釈抗ミオシン抗体で幼虫をインキュベートします。 注：推奨される希釈範囲は、抗体のデータシートに通常です。互いに異なる種に対して惹起されたとのこともdiffeされている抗体を選択してください組織に借ります。 PBTで15分間幼虫の6倍を洗ってください。 PBTの5％血清中で1〜2時間ブロックします。 暗闇の中で二次抗体でインキュベートします。特定の抗体のための5％血清およびPBT中の適切な希釈で蛍光標識した抗マウス（550）および抗ウサギ（488）二次抗体を使用してください。 できるだけ早く10X共焦点顕微鏡上のPBTと画像内の各10分間洗浄6X。 イメージング筋骨格ジオメトリ Danieauの溶液16中のぬるい0.3から0.5パーセントの低融点（LMP）アガロース中のカバースリップ上で腹側幼虫をマウントします。 注：トランスジェニック魚は、装着前と撮像中に0.02％MS222（トリカインメタンスルホン酸、pHが7）で鎮静される必要があります。 10倍対物レンズと、約2.5倍デジタルズームを使用して、関心領域の共焦点画像スタックしてください。 488 nmおよび561のnを使用して、緑と赤チャンネルの画像を用意mはそれぞれレーザーです。 1.3ミクロンと3ライン平均値のZ面の間の間隔が512×512ピクセルの解像度での画像。結果のスタックは約100 zのスライスで構成されます。 tiffのシリーズとしてデータをエクスポートします。 5dpfゼブラフィッシュ幼虫から筋肉および軟骨の要素の最大投影は、図1に示されています。 2. 3Dサーフェスの生成 3、4、5、DPFの各時点での代表的なデータセットを選択してください（複数のサンプルの可視化の後に選択します）。 3次元tiffのスタックを開き、解析ソフトウェアのすべてのチャネルを選択します。右軟骨チャンネルをクリックして、画像フィルタと平滑化を選択：ガウス（ 図2B）。 プロジェクトビューで右フィルタ処理された画像を上にクリックして、「画像分割」を選択し、「新しいラベルを編集します」。各材料、 すなわち、軟骨とjのための新しいラベルを作成します。OINT。魔法の杖ツールを使って画像の軟骨領域（ 図2C、白信号、紫色のアウトライン）を選択します。アウトラインからノイズを除去するブラシツールを使用してください。 注：魔法の杖ツールを使用している場合、「すべてのスライス」をクリックします。 ブラシツールと共同で地域を選択して、関節構成要素に割り当てる（ 図2C、青のアウトライン） トップメニューと滑らかなラベルでセグメンテーションを選択することにより、一度に滑らかな複数のスライス。右の画像をクリックして、3D表面は、コンポーネント（ 図2D）のレンダリング生成するために表面を生成する]を選択します。 面をクリックして、メッシュ生成ソフトにインポートするhmasciiファイルとしてデータを保存します。 3. FEモデルで使用される筋力の計算 smyhcの共焦点画像からの筋線維の数を数える：GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ（ 図1A、矢じり、1C）とDIAMを測定繊維の計は、その断面積を計算する（πR2）。 文献からの筋肉単位面積あたりの適切な力を識別します。幼生ゼブラフィッシュ骨格筋（40 nNの個/μm2）の単位面積当たりに発生最大筋力17を使用しました。 単位面積当たりの力によって繊維の数とその面積を乗じて各解剖学的筋肉群のための力を計算します。 表1を参照してください。 4.メッシュの生成有限要素メッシュを生成することができるソフトウェアパッケージにセクション2（上記）で生成された3Dモデルをインポートします。 2Dメニューのシュリンクラップ・ツールを使用して、軟骨および接合面のA2Dメッシュを生成します。適切な要素サイズを選択します。 注：1.5から2.5の間の要素サイズを使用します。必要に応じて、異なるサイズの2次元面の範囲を生成する3次元メッシュ最適化（セクション4を行うことが噛合しています。4）。 '> 2D>ツール要素チェック]の下にあるメッシュ品質チェックを行うメッシュ内の重複した要素、挿入および貫通をチェックするためのパネルを。モデルツリーでユーティリティ]タブを使用して二面角を修正しました。 3D> tetrameshをサブパネルを使用して、要素の大きさの異なる2次元表面メッシュから3Dメッシュを生成します。 注：異なるメッシュサイズの結果を比較し、さらにシミュレーション後に収束し、機能の定義を損なわない最低のメッシュサイズでFEモデルを選択します。 図3の例では、下顎軟骨のための150万四面体要素が含まれており、2.0の2D要素サイズを有していました。 顎モデルはジオメトリ>距離のサブパネルを用いた共焦点スタックごとにスケールすることですので、メッシュを変換します。 注：軟骨を確認して、関節構成要素がマージされたモデルをエクスポートすることにより、またはタイを使用してモデルに接続されています。 5.有限要素のModエル建設商業有限要素（FE）ソフトウェアを使用して、FEモデルを作成します。ガイドとしてセクション1で生成された共焦点スタックをラベルされた3Dの筋肉や軟骨を使用して、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。各筋肉（ 図3）の起源と挿入を表す2つのノード間のベクトルを作成します。 各筋肉のための 'C・ロード」を適用するタイプの歴史」のロードコレクタを作成します。 （ステップ3.3で計算）ニュートンで大きさを指定し、関連するベクトルを割り当てる。 図3は、内転下顎（AM）、分度器hyoideus（PH）とintermandibularis（IM）のための接続点を示しています。 注：これらの顎の筋肉の場合、最大の収縮力は、各負荷の50％のみが、各サイトで適用されるように、原点と挿入の間に分配されます。 文献によって決定されるような適切な弾性等方性材料特性を割り当てます。軟骨のためのヤング率このモデルではゾーン間はそれぞれ1.1 MPaの0.25 MPaであったとポアソン比は両方18,19のために0.25でした。 モデルの初期の制約を適用するタイプ '境界」のロードコレクタを作成します。タブの分析>制約に移動して、作成サブパネルで、あなたが制約したいモデル上のノードを選択します。その動きの自然な範囲の最良の近似にモデルの動きを制限する自由（DOF）の度を選択します。 注： 図3のモデルは、動きの全ての軸に拘束したモデルでとで中間点に空間にそれを固定する舌骨角の時（DOF 1、2、3はそれぞれx、yおよびzを表します） palatoquadrateはゼブラフィッシュ頭蓋の残りの部分に接続する時点でy及びz軸（ 図3、 表1）。モデルは、1つ以上のノードにすべての3つの自由度に制限される必要があります。 あなたはサイマルしたい運動の種類ごとに、「ロード・ステップ」を作成します。分析メニューの下で、（ すなわち、開口部、閉鎖を）食べて、この動きをシミュレートするために、（5.4節で行われた）と制約（セクション5.2で行われた）関連するすべての負荷を選択します。それが表示されたら、ドロップダウンメニューから「静的」を選択します。 この場合には、メッシュ、荷重、拘束と適切なファイル形式の材料特性などの輸出モデル、「.INP」形式。 FE解析ソフトウェアへの負荷モデル。ジョブモジュールを使用して、モデルの仕事を作成し、実行します。 結果タブと可視化メニューにあるなど 、応力、ひずみ、変位、のための出力を分析した （ 図4および5）。 顎変形/変位距離の6検証トランスジェニックゼブラフィッシュ：3-6のTg（mCherryをCol2a1aBAC）を選択します 。 彼らは触れることなく、彼らの心はまだ鼓動している回答するのをやめるまで軽く0.02％MS222との幼虫をanaesthetize。 マウント横方向にぬるい1％LMPアガロースでカバースリップ上（麻酔をかけながら）（Danieauの溶液中に作られた）の幼虫。 鉗子で頭とあごの周りからアガロースを削除してください。 通常の口の動きが再開されるまで、パスツールピペットを使用して麻酔を除去するために、幼虫の頭の上（無MS222付き）新鮮Danieauのソリューションをフラッシュします。 口の動きの明視野高速ビデオを撮影する動画キャプチャソフトウェアを使用してください。最も高いフレームレートで1分の持続時間の周りの映画を撮る、または十分な顎の開口部の複数のサイクルを記録します。 その最大変位にオープンジョーを表示するフレームを選択してください。 μm単位でメッケル軟骨および上顎（篩骨プレートの先端）の前部先端との間の距離を測定します。 複数の稚魚からの平均変位を計算します。 モデルから変位データを抽出します。 （モデル変位の挙動を確認するために、6.8で算出した平均変位を使用します<stronグラム>図4）。モデルが予想から外れる場合は、順次材料特性と筋肉の負荷を変化させることによって、感度分析を実行します。