Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em> C. elegans</em
Summary
Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
Ileri genetik ekranlar yaygın olarak Caenorhabditis elegans (C. elegans: 1) gibi model organizmaların çeşitli biyolojik süreçleri bozarak genetik mutantlarını üretmek için kullanılmıştır. Bu tür mutantlar analizleri işlevsel olarak önemli genlerin keşfi yol ve sinyalizasyon 1,2 yolaklarıyla. Geleneksel olarak, C. mutagenez elegans mutajenik kimyasallar, radyasyon, veya transpozonlar 2 kullanılarak elde edilir. Örneğin etil metansülfonat (EMS) ve N-etil-N -nitrosourea (TRK) insanlar için toksik olduğu gibi kimyasalları; gama ışını ya da ultraviyole (UV) radyasyon mutagenez özel ekipman gerektirir; ve Mutator suşları 3 gibi transpozon aktif suşları, bakım sırasında gereksiz mutasyonlara neden olabilir. Biz genetik olarak kodlanmış foto 4 kullanılarak kalıtsal mutasyonlar ikna etmek için basit bir yaklaşım geliştirdik.
Reaktif Oksijen Türleri (ROS) DNA 5 zarar verebilir.Mini Singlet Oksijen Jeneratörü (miniSOG) DL (Işık, Oksijen ve Voltaj) için tasarlanmış olan 106 amino asit Arabidopsis phototropin 2 6 etki bir yeşil floresan protein. Mavi ışık (~ 450 nm), miniSOG maruz kalma üzerine ROS bütün hücrelerde mevcut olan bir kofaktör 6-8 olarak fl avin mononükleotid singlet oksijen de dahil olmak üzere oluşturur. Bu histon-72, bir C, C-terminaline miniSOG etiketleyerek bir His-MSOG füzyon proteinini inşa Histon 3. elegans varyantı Bunun C tohum çizgisinden Onun-MSOG ifade etmek için bir tek kopya transgen 9 oluşturulan elegans. karanlıkta normal kültür koşulları altında, His-MSOG transgenik solucanlar, normal kuluçka büyüklüğü ve ömrü 4 var. Mavi LED ışığına maruz kalma üzerine, His-MSOG solucanlar soylarına 4 arasında kalıtsal mutasyonlara üretir. T: C: A ve G: C C: G ve küçük chromoso indüklenen mutasyon spektrumu, G gibi nükleotid değişiklikleri içerirBana 4 silmeleri. Bu mutagenez prosedürü gerçekleştirmek için basit ve minimal laboratuvar güvenliği kurulum gerektirir. Burada, optogenetic mutagenez için LED aydınlatma kurulum ve prosedürler açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Optogenetic mutagenez ayrıntılı bir prosedür His-MSOG germline ifade ile ve küçük ölçekli bir ileri genetik ekranının bir örneğini sağlar tarif eder. standart kimyasal mutajenezi ile karşılaştırıldığında, bu Optogenetic mutajenez yöntemi, bir çok avantaja sahiptir. Öncelikle, bu sayede uzak gibi EMS, TRK gibi toksik kimyasal mutajen gelen laboratuar personelinin tutmak ve ultraviyole ışık (TMP / UV) ile Trimethylpsoralen, zehirsizdir. İkinci olarak, mutagenez deney prosedürü, p <su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
Referencias
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of “miniSOG,” a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4–SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genética. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
