Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em> Drosophila</em
Summary
Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.
Abstract
Progressieve neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD) is een toenemend gevaar voor de volksgezondheid wereldwijd. Hoewel zoogdierlijke modellen belangrijke inzichten verschaft in de onderliggende mechanismen van pathogeniciteit, de complexiteit van zoogdierlijke systemen met hun hoge kosten beperken het gebruik ervan. Daarom is de eenvoudige, maar goed ingeburgerde Drosophila model-systeem biedt een alternatief voor het onderzoeken van de moleculaire pathways die worden beïnvloed bij deze ziekten. Naast afwijkend gedrag, zijn neurodegeneratieve ziekten gekenmerkt door histologische fenotypes zoals neuronale dood en axonopathie. Neuronale degeneratie kwantificeren en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door genetische en omgevingsfactoren, gebruiken we een histologische benadering die is gebaseerd op het meten van de vacuolen bij volwassen vliegen hersenen. Om de effecten van systematische fout te minimaliseren en om direct te vergelijken secties van de bedienings- en experimental vliegen in één preparaat, gebruiken we de 'kraag' methode voor paraffine secties. Neurodegeneratie wordt vervolgens beoordeeld door het meten van de afmeting en / of het aantal vacuolen die zijn ontstaan in de vlieg hersenen. Dit kan worden gedaan door te focussen op een specifiek gebied van belang of door analyse van de hele hersenen door het verkrijgen van seriecoupes dat de volledige kop overspannen. Daarom is deze werkwijze kan men niet alleen de degeneratie maar ook relatief mild fenotypes die alleen detecteerbaar in enkele secties te meten, zoals optreedt tijdens normale veroudering.
Introduction
Met de stijging van de levensverwachting, hebben neurodegeneratieve ziekten als Alzheimer of Parkinson's een steeds grotere bedreiging voor de algemene bevolking gezondheid geworden. Volgens de National Institutes of Health, 115 miljoen mensen wereldwijd wordt voorspeld te worden getroffen door dementie in 2050. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de identificatie van genen en risicofactoren betrokken bij ten minste enkele van deze ziekten, voor velen van hen, de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onbekend of niet goed begrepen.
Eenvoudige ongewervelde modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans es Drosophila melanogaster bieden een verscheidenheid aan experimentele voordelen aan de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van een korte levenscyclus, groot aantal nakomelingen, en de beschikbaarheid van gevestigde en soms unieke genetische en moleculaire methoden 1 bestuderen -12. Bovendien zijn deze organismen vatbaar onbevooroordeeldeinteractie schermen die factoren die bijdragen aan deze ziekten door hun verzwarende of verbetering van effecten op neurodegeneratieve fenotypes kunnen identificeren.
Het analyseren van dergelijke genetische interacties en de beoordeling van de vergrijzing effecten vereist kwantitatieve protocollen tot neurodegeneratie te detecteren en de ernst ervan te meten. Deze beoordeling kan relatief eenvoudig worden gedaan bij het meten van gedragsaspecten in Drosophila, zoals olfactorische leren, negatief geotaxis, of snel phototaxis, die een numerieke voorstelling waarde 13-21 te bieden. Het is ook mogelijk om de effecten op neuronale overleving te bepalen door het tellen van neuronen. Dit is echter alleen mogelijk wanneer gericht op een specifieke populatie, dat is duidelijk herkenbaar, net als de dopaminerge neuronen die worden beïnvloed in PD, en zelfs dan zijn de resultaten controversieel 22-24 geweest.
De hier beschreven protocol gebruikt de kraag methode paraffine seriecoupes voeren, een werkwijzedat werd oorspronkelijk ontwikkeld door Heisenberg en Böhl, die het gebruikt om anatomische hersenen mutanten te isoleren in Drosophila 25. Het gebruik van de kraag methode is vervolgens aangepast, zoals in vriescoupes, vibratoomcoupes en plastic secties 26-28. Hier wordt deze werkwijze toegepast op opeenvolgende coupes van de hele vlieg kop, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de vacuolen die zich ontwikkelen in vliegen met neurodegeneratieve fenotypes 16,21,29-32 meten verkrijgen. Deze metingen kunnen worden gedaan in specifieke hersengebieden of kan de gehele hersenen bedekken; de laatste benadering maakt het mogelijk om zelfs zwakke degeneratieve fenotypes te identificeren, zoals waargenomen tijdens veroudering. Tenslotte, bij gebruik van de kragen, tot 20 vliegen worden verwerkt als één preparaat, dat niet alleen minder tijdrovend, maar ook zorgt voor de analyse van controle en experimentele vliegen in hetzelfde preparaat, geminimaliseerd artefacten als gevolg van kleine veranderingen in de voorbereiding.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven werkwijze verschaft een middel om neurodegeneratie te kwantificeren in de hersenen van Drosophila. Terwijl andere methoden, zoals het tellen van een bepaald celtype, kan worden gebruikt om neurodegeneratie te identificeren, het voordeel van deze methode is dat het algemeen kan worden toegepast. Tellen cellen vereist dat deze cellen op betrouwbare wijze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een specifiek antilichaam of de expressie van een cel-specifieke marker, die niet altijd beschikbaar …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
Referencias
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer’s disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson’s disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
