افتعال أشعة فوق البنفسجية فيس ورامان الطيفي المناعية منصة
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
تستخدم المناعية للكشف عن البروتينات بناء على وجود الأجسام المضادة المرتبطة بها. بسبب الاستخدام الواسع النطاق في مجال البحوث والسريرية، بنية تحتية كبيرة من الأدوات والمواد المناعية يمكن العثور عليه. على سبيل المثال، 96- و 384 جيدا هي لوحات البوليسترين المتاحة تجاريا ولها تصميم موحد لاستيعاب (أشعة فوق البنفسجية فيس) آلات التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية من مختلف المصنعين. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر مجموعة واسعة من المناعية، والعلامات الكشف، وكلاء عرقلة للتصاميم المناعية مخصصة مثل المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
وعلى الرغم من البنية التحتية القائمة، ومجموعات ELISA القياسية لا تلبي كل الاحتياجات البحثية، الأمر الذي يتطلب تطوير المناعية الفردية، التي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. على سبيل المثال، مجموعات ELISA لها مضاعفة منخفض (الكشف عن تحليلها أكثر من واحد في وقت واحد) قدرات لأنها تعتمد عادة على مضان أو عمودطرق orimetric للكشف. اللونية والتحليلات تستند الفلورسنت محدودة القدرات مضاعفة بسبب قمم الطيفية واسعة. في المقابل، أساليب تعتمد على التحليل الطيفي رامان لديها قدرة أكبر بكثير لمضاعفة بسبب قمم الانبعاثات الضيقة. ميزة أخرى لرامان الطيفي هو أن صحفيين رامان تجربة أقل بكثير photobleaching من من علامات الفلورسنت 1. وعلى الرغم من المزايا التي صحفيين رامان يكون على استخدام علامات الفلورسنت واللونية والبروتوكولات لافتعال المناعية أساس رامان محدودة. والغرض من هذه الورقة هو توفير بروتوكول لإعداد تحقيقات functionalized لاستخدام جنبا إلى جنب مع لوحات البوليسترين للكشف المباشر في التحاليل عن طريق تحليل أشعة فوق البنفسجية فيس ورامان الطيفي. سوف يسمح هذا البروتوكول الباحثين لاتخاذ نهج افعل ذلك بنفسك للكشف متعدد تحليلها في المستقبل مع الاستفادة من البنية التحتية سلفا.
Introduction
المناعية شطيرة نموذجية كشف بشكل غير مباشر وجود مستضد باستخدام اثنين من الأجسام المضادة. لا بد من الأجسام المضادة القبض على سطح صلب ويشكل مجمع الضد مستضد عندما تكون في القرب من المستضد المناسب. ثم يتم إدخال الأجسام المضادة كشف وبربط المستضد. بعد الغسيل، يتم الكشف عن / مستضد / بقايا معقدة الضد الضد والضد الكشف عن المسمى كما هو موضح في الشكل 1A. ويتم الكشف النموذجية التي كتبها كاشف الفلورسنت أو اللونية، والحد من مضاعفة إلى 10 التحاليل بسبب قمم الطيفية واسعة 2،3. في المقابل، النظم القائمة رامان بوجود قمم الانبعاثات أضيق بكثير مما أدى إلى تعزيز القدرات المتنوعة مع مصادر تدعي كشف في وقت واحد تصل إلى 100 التحاليل 2،3.
كثيرة مصادر الأدب المتاحة التي تغطي جوانب هامة تتعلق المناعية 4-6 مثل خطوة بخطوةتفاصيل لخلق مجموعات ELISA شخصية. للأسف، هذه البروتوكولات هي للكشف عن الفلورسنت أو اللونية، مما يحد من قدرة مضاعفة المناعية حسب الطلب. لتلبية هذه الحاجة، نقدم إجراءات مفصلة لافتعال أشعة فوق البنفسجية فيس / رامان المناعية التي نشرت سابقا 7 لالمناعي المباشر كما هو موضح في الشكل 1B.
ويشمل هذا البروتوكول تلفيق تحقيقات القائم على جسيمات متناهية الصغر من الذهب functionalized، هو موضح في الشكل (2). الإجراء لجعل تحقيقات / الأشعة فوق البنفسجية فيس رامان يبدأ ملزمة للصحفيين رامان على سطح جزيئات الذهب (AuNPs). ثم يتم functionalized وAuNPs مع الأجسام المضادة التي ترتبط مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG). يتم حظر المتبقية مواقع ملزمة للAuNPs عن طريق الربط ميثوكسي ثيول البولي ايثيلين جلايكول (MPEG-SH) لAuNPs لمنع اللاحقة غير محددة وملزمة أثناء التحليل. يتم اختبار تحقيقات AuNP أعدها ملزمة لمستضداتثابت إلى آبار لوحة البوليسترين كما هو موضح في الشكل 1B. على غسل لوحة، تحقيقات AuNP يتم الكشف عنها باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس بينما تم الكشف للصحفيين رامان المرتبطة رامان الطيفي. الجمع بين البيانات أشعة فوق البنفسجية فيس ورامان الطيفي يوفر طريقتين من التحليلات، وتعزيز قدرات هذا المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في بروتوكول مفصلة، وهناك العديد من النقاط الحرجة للتصدي ل. قضية واحدة هي خيار مراسل رامان وجسيمات متناهية الصغر من الذهب. وعلى الرغم من كتابة البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام الفردي، تم استخدام رامان مراسل مركز دبي كمثال على ذلك. مركز دبي هو مراسل موجبة الشحنة و?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
Referencias
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
