Utilizzando la tecnologia di stampa 3D per unire RM con Istologia: Un protocollo per Brain Sezioni
Summary
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di allineare con precisione magnetici volumi di immagini di risonanza (MRI) con sezioni istologia attraverso la creazione di supporti cervello 3D-stampati personalizzati e scatole affettatrice.
Abstract
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
Introduction
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui delineato permette un confronto preciso tra la risonanza magnetica e le sezioni istologia. Il protocollo è presentato in un formato unificato che può essere applicato al cervello umano o piccoli animali, come marmoset o roditori. Differenze specifiche per grandi (umana) e piccole (primati non umani e roditori) cervelli sono evidenziati, e nel video che accompagna e le cifre dimostrano che l'applicazione nel marmoset. Anche se il metodo è semplice, il metodo richiede molti passaggi e l'uso di diversi tipi di software. Inoltre, diversi problemi potenzialmente influenzano l'accuratezza di questo metodo sono importanti da menzionare.
La qualità dell'immagine del in vivo MRI è un fattore importante. Per ridurre al minimo la disparità nella risoluzione delle immagini tra RM e immagini digitalizzate istologia, dovrebbe essere usata la dimensione più piccola possibile MRI voxel. Questo concetto vale anche per la qualità delle immagini della risonanza magnetica post-mortem. Mentre l'aumentotempo di acquisizione a risonanza magnetica post-mortem permette risoluzione molto più elevata, la preparazione può introdurre artefatti come perdite di segnale focali relativi a bolle d'aria. Tali manufatti possono oscurare zone del tessuto nonché incidere suo contorno. Inoltre, le dimensioni del tessuto sulla post-mortem MRI sono suscettibili di essere interessate dal processo di fissazione e durata. Mentre in vivo per ex vivo partita risonanza magnetica può essere strettamente approssimato utilizzando punti di repere anatomici in configurazione geometria fetta durante l'acquisizione, la registrazione non lineare sarebbe ancora necessario per raggiungere un più alto grado di precisione in corrispondenza queste due immagini MRI.
Il disegno del titolare cervello e affettatrice è anche un passo cruciale. Nel creare il modello digitale del cervello, un algoritmo di smoothing viene applicato che un po 'allarga il modello relativo al cervello fisso. Ciò consente un facile inserimento del cervello nel relativo supporto e affettatrice e riduce spigoli vivi nel supporto &# 39; s contorno. Tuttavia, se il modello è troppo grande (ad esempio, più del 5%), il cervello potrebbe spostarsi durante l'autopsia MRI e / o sezionamento. Un altro punto importante è quello di adattare il design del modello cervello in modo che il cervelletto sia correttamente posizionato all'interno dell'oggetto 3D stampata. Questo può essere particolarmente difficile quando il cervelletto è stato danneggiato durante l'estrazione del cervello durante l'autopsia.
Quando si stampa l'affettatrice cervello e supporto, del tipo di stampante 3D deve essere scelto con attenzione. Alcune stampanti multi-getto richiedono post-elaborazione utilizzando un forno per rimuovere il materiale di supporto. Mentre queste stampanti possono produrre oggetti che sono a tenuta stagna e relativamente più durevole stampanti tavolo fusa Deposition Modeling (FDM), il processo di riscaldamento per rimuovere supporti possono leggermente deformarsi casella, creando lacune lama non perfettamente perpendicolari al contorno cervello.
Il processo cerebrale di sezionamento è un altro passo fondamentale. Prima di tagliare °e intero cervello in lastre, è importante accertarsi che il cervello è seduto saldamente all'interno del affettatrice cervello: ci dovrebbero essere movimento quando leggera pressione viene applicata sulla cervello. In questo modo sarà possibile per le lame per tagliare attraverso il cervello nella posizione esatta impostata dagli investigatori. Un continuo, a pressione equilibrata dovrebbe essere applicato a entrambi i titolari della lama durante il taglio. A seconda della nitidezza delle lame e la rigidità del tessuto, un leggero movimento di taglio trasversale potrebbe essere vantaggioso per mantenere la superficie di taglio piane.
Il processo di paraffina-embedding può anche essere una fonte di disallineamento tra risonanza magnetica e l'istologia. Se la lastra di tessuto non è seduto piatto contro la cassetta durante il processo di incorporazione, ci sarà una inclinazione tra il piano di taglio del microtomo e il luogo superficie della lastra. Ciò richiederà taglio sezioni inutilizzabili per trovare una superficie piana in cui tutto il tessuto è esposto. Un modo per correggere l'inclinazioneè cambiando l'angolo del piano visualizzazione su l'autopsia MRI ad alta isotropo risoluzione. Tuttavia, questo è quasi impossibile da eseguire sul vivo MRI in che di solito è acquisito con risoluzione anisotropo (tipicamente spesse fette coronali).
Infine, il tessuto può sperimentare alcuni deformazione durante il periodo in formalina fissazione e paraffina (ritiro), nonché durante la preparazione dei vetrini (pieghevoli, screpolature, rughe). Alcune di queste deformazioni possono essere corretti mettendo i 4-5 sezioni micron in un bagno d'acqua prima di trasferire su vetrini. Altre deformazioni possono essere in parte risolti eseguendo deformabile immagine coregistrazione delle immagini digitalizzate istologiche alle immagini MRI post mortem. Tuttavia, riducendo al minimo le deformazioni con un'attenta e qualificata la pratica è l'approccio più efficace per corrispondenza volumi risonanza magnetica per Istologia sezioni.
In conclusione, la metodologia qui presentata consente investigators di valutare con precisione la patologia sottostante dei risultati di risonanza magnetica. Più in generale, si tratta di un approccio promettente per l'identificazione e / o convalidare biomarcatori MRI innovativi per studi di ricerca che hanno come target processi patologici specifici, come infiammazioni o rimielinizzazione.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
Materials
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software | |
Referencias
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- ‘t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
