Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
Cytotoxicité des cellules NK est une mesure largement utilisée pour déterminer l'effet d'une intervention extérieure sur la fonction des cellules NK. Cependant, la précision et la reproductibilité de cet essai peut être considéré comme instable, soit à cause des erreurs de l'utilisateur ou du fait de la sensibilité des cellules NK à une manipulation expérimentale. Pour éliminer ces problèmes, un flux de travail qui les réduit à un minimum a été créé et est présenté ici. Pour illustrer, nous avons obtenu des échantillons de sang, à divers moments, des coureurs (n = 4) qui ont été soumis à un combat intense d'exercice. Tout d'abord, les cellules NK sont simultanément identifiés et isolés par CD56 de marquage et de tri magnétique à base, directement à partir de sang total et d'aussi peu que un millilitre. Les cellules NK triées sont retirées de tous les anticorps de réactifs ou de coiffage. Ils peuvent être comptés afin d'établir un décompte précis des cellules NK par millilitre de sang. Deuxièmement, les cellules NK (cellules triées effecteurs ou E) peuvent être mélangés avec 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perchlorate (DIO) marqué des cellules K562 (cellules cibles ou T) à un 1 dosage optimal: 5 T: rapport E et analysé à l'aide d'un flux-cytomètre d'imagerie qui permet la visualisation de chaque événement et l'élimination de tout faux positif ou de faux négatifs (tels que des doublets ou des cellules effectrices). Ce flux de travail peut être complété en environ 4 h, et permet des résultats très stables, même lorsque l'on travaille avec des échantillons humains. Lorsqu'elles sont disponibles, les équipes de recherche peuvent tester plusieurs interventions expérimentales chez des sujets humains, et de comparer les mesures à travers plusieurs points de temps sans compromettre l'intégrité des données.
Introduction
Les cellules tueuses naturelles sont un élément essentiel du système immunitaire inné. Alors qu'ils sont très réglementés, ils ont la capacité de reconnaître et d' éliminer les cellules anormales par contact de cellule à cellule et sans activation préalable 1. En tant que tel, ils forment une ligne rapide de défense contre les infections. L' exercice, surtout intense a été montré pour déprimer le système immunitaire transitoirement 2, 3, 4, 5. Les cellules NK sont particulièrement sujettes à cet effet , 4, 6, 7, créant ainsi une fenêtre d' une sensibilité accrue aux maladies. Par conséquent, l'étude des interventions avant, pendant ou après un exercice intense dans le but de réduire son impact sur la fonction des cellules NK est d'un intérêt particulier pour le bien-être des athlètes post-concours.
<p class= "jove_content"> Toutefois, l'étude de ces interventions est compliquée par de nombreux facteurs: 1) les cellules NK sont rares 8, à environ 1% du blanc compartiment des cellules sanguines; 2) Les cellules NK sont très sensibles au stress et reposent sur une exposition constante à des conditions physiologiques pour rester viable et stable au cours de l'expérimentation; et 3) des tests standard pour déterminer la cytotoxicité des cellules NK, tels que les gradients de Ficoll 9 et libèrent des essais 10, ne sont pas fiables et incohérentes. La variabilité inhérente des échantillons humains ne font qu'aggraver ces problèmes. échantillons humains frais prélevés lors d'interventions sont assez réglementé et difficile à se procurer, au moins par rapport à des échantillons d'animaux ou de lignées cellulaires immortalisées. Cela réduit les possibilités de répéter des expériences ou ajouter des participants à la cohorte de l'étude pour atteindre les seuils statistiques significatives. Collectivement, ces questions prennent en charge la nécessité d'un protocole simplifié qui permet for à la fois à haut débit et une analyse de haute fiabilité de NK activité lytique des cellules dans des échantillons humains.Nous avons établi un flux de travail qui réduit le temps nécessaire pour identifier, isoler et les cellules NK de test à partir de sang total humain, tout en minimisant l'exposition à des facteurs externes. La méthode optimise l'utilisation des deux instruments, un trieur magnétique à base de cellules et d'un flux d'imagerie cytomètre et un spécifique de test, T optimisé: rapport E pour permettre la détection d'une diminution ou une augmentation de cytotoxicité des cellules NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans cette étude mesure directement l'activité spécifique des cellules NK d'un individu en réponse à des stimuli (dans ce cas particulier, l'exercice prolongé). Typiquement, les cellules NK sont isolées à partir de sang en utilisant un gradient de densité ou de tri cellulaire en utilisant une combinaison de marqueurs. Bien que ces méthodes sont largement utilisées, elles présentent de nombreux inconvénients: ils prennent beaucoup de temps, impliquent de multiples manipulatio…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
Referencias
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
