기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는
Summary
Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Abstract
암 기능 드라이버 이벤트의 식별 새로운 약물 표적의 다음 세대의 발견을위한 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전의 중심과 필수적이다. 그것은 암의 더 복잡한 모델은 생체 내에서 종양을 유도하고 임상 시험에 대한 전임상 모델에서 전환을 새로운 치료법의 효능을 증가 기여 요인을 완벽하게 감사하는 데 필요한 것이 명백 해지고있다.
여기에서 우리는 siRNA의 기능 검사를 실시 할 수 균일하고 재현성 종양 회전 타원체를 생성하는 방법을 제시한다. 이 타원체는 기존의 두 차원 문화에 존재하지 않는 고형 종양에서 발견되는 많은 특성을 표시합니다. 우리는 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주이 프로토콜 의무가있는 것으로 나타났다. 더욱이, 우리는 원리 증명 유방암 세포주 BT474을 이용하여 데이터를 제공하는, 그 확인포스파티딜 이노시톨 -4,5- biphosphate 3- 키나아제 (PIK3CA)의 상피 세포 성장 인자 수용체 및 HER2의 증폭에 돌연변이 의존성 종양 타원체로 성장 될 때. 마지막으로, 우리는 더 조사하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 이러한 종속성의 공간에 미치는 영향을 확인 할 수 있습니다.
Introduction
고형 종양은 성공적으로 환자를 치료할 수있는 상당한 도전 과제를 제시 상당한 임상 학적, 유전 미세 환경 내 종양 얼룩이 표시. 신규를 식별하는 데 사용되는 모델의 대부분은 이러한 치료의 많은 기능을 포함하지 않는 타겟. 실제로, 병원에서 사용되는 현재의 타겟 치료법 2 차원 배양 조건 하에서 성장 암세포에 의존하는 스크리닝 방법을 이용 지난 10 년간 개발되어왔다. 이 같은 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 다양한 성공, 초래되었지만, 이는 암의 더 복잡한 모델이 완전히 생체 내에서 종양을 유도으로부터 전환 할 새로운 치료법의 수를 늘리 요인을 인식하는 데 필요한 것을 알 수 있다는 임상 시험에 대한 전임상 모델. 또한, 이제도 2 차원 배양 시스템에 반영하지 못하는 것을 알 수있다동작 1, 2를 생체 내. 예를 들어, 종양 혈관 저조한에 미세 환경 내에서 산소 및 영양분에 대한 수요가 공급을 능가 같은 높고 낮은 배달 지역 개발한다. 같은 탄산 탈수 효소 IX (CAIX)로 설립 저산소 마커에 대한 종양 부분의 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 된 종양에서 낮은 산소 (저산소증)의 존재는, 유방암에 가난한 임상 결과 3,4 따라서 통합 기능 등으로 상관 관계 심사 모델에 저산소증은 생체 내에서 더 효과가있을 것입니다 새로운 약물 표적을 발견하는 우리의 능력을 향상시킬 수있다. 사실, 저산소증을 포함 성공적 대상으로 공격적인 종양은 임상 우선 순위 5입니다.
보다 정확하게 종양 미세 암세포 의해 발생 조건 요소 요점을 되풀이하는 시도 전통적인 2D siRNA를 선별의 변질은 여러 유전자의 동정하게되었다 번째생체 내에서 종양 성장에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이러한 낮은 혈청 조건 (6), 저산소 조건 7에서 조합 8에서 수행 기능 유전체학 화면을 포함한다. 낮은 혈청에서 성장 예를 들어, 6 Phosphofructo -2- 아제 / 프 룩토 오스 -2,6- Biphosphatase 4 (PFKFB4) 탄소 입력 당분 조절을 담당하는 단백질의 침묵 만 전이로부터 유래 전립선 암 라인 아폽토시스 유도. 동일한 조건 하에서 정상적인 전립선 세포주 PFKFB4의 침묵은 반면 PFKFB4 고갈 완전히 전립선 암 세포주의 성장은 6 이종 절제 아무런 영향을 미치지 않았다.
유방암 세포주 연장 패널의 모노 카르 복실 트랜스 -4- (MCT4)의 입을 우선적 저산소 조건에서 세포주 성장의 감소를 이끌었다. 이 취약점은 유방암 세포주 직교 이방성의 xenogra에서 생체 내에서 검증 된FTS. 영양 스트레스 조건에서 아마도 가장 현저하게, 아세틸 -CoA 신테 2 (ACSS2) 아세틸 -CoA로 아세트산 변환을 담당하는 효소의 입을 저감 암세포 번호 (저산소 혈청)하지만 정상 배양 조건에서 거의 또는 전혀 영향을 미치지 8. ACSS2의 절제 영양소 구배는 종양 미세 환경 내에서 이러한 영역들에있는 세포가 종양 진행 8에 필수적인 것을 단독으로 존재하지 않는 것이 제안 유방암과 전립선 암 이종 이식편의 성장에 영향. 또한 ACSS2은 종양에서 증가 ACSS2 활성이 바람직하지 않은 조건 하에서 성장을 지원하는 기본 메커니즘이 될 수 있음을 시사하고 교 모세포종, 간세포 암종 9,10 중요한 것으로 밝혀졌다.
종합적으로, 이러한 연구는 생체 내에서 발생하는 조건을 recapitulating와 siRNA의 화면을 수행하는 단계 (G)의 식별을 가능하게 증명암 생존을위한 필수 ENES. 뿐만 아니라 영양소의 스트레스 조건 하에서 2D 암 세포의 성장에 영향을 미치는, 이러한 연구에서 표적 유전자의 결핍 종양 이종 이식 6,8- 관찰되었다 미러링 어떤 암 세포주 타원체의 성장을 억제 하였다. 따라서, 암세포는 타원체 ACSS2 사일런 싱에 대한 민감성을 부여 종양 미세 환경에서 발생하는 조건의 몇몇 함유한다. 실제로 타원체 영양소 구배 (혈중 산소) pH의 변화를 표시, 3 차원 (3D) 세포 – 세포 접촉뿐만 아니라, 세포주기 정지 및 아폽토시스를받은 세포 증식 민첩함의 변화. 이는 괴사 지역의 암 회전 타원체의 존재에 의해 예로, 기능은 기존의 2D 문화에서 찾을 수 없습니다.
암세포 타원체 이미 소분자 억제제를 스크리닝하는 것이 더 중요한 생물학적 모델로 사용되고 있지만, 이것은 화합물의 효능 검증 또는 콤포넌트의 용도 변경을 허용했다unds 원래 다른 질병 (11)을 위해 디자인. 현재 구형 스크리닝 방법은 고 함량으로 높은 처리량의 특정 유전자 파괴의 분석을 허용하지 않는다. 여기서는 처음 설명 암 세포주 타원체 작은 간섭 RNA (siRNA를) 기술을 이용하여 특정 유전자의 의존성을 폭로하는 기능 유전체학 파이프 라인. 우리는 인간의 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 대상으로 siRNA를 가진 주문품의 라이브러리를 설계 BT474 유방암 구 상체의 회전 타원체의 크기와 신진 대사 활동에 유전자 결핍의 영향을 평가 하였다. 우리는 견고하고 재현성 ERBB2와 PIK3CA는 3D 문화에서 침묵의 영향을 감지 할 수 있었다. 또한, 우리는 면역 조직 화학 법을 사용 BT474의 타원체의 공간 구조에 대한 유전자 파괴의 효과를 평가할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암의 3 차원 모델을 더욱 선택적으로 암세포를 죽이기 위해 설계되었다 공지 및 신규 화합물의 효능을 평가하기 위해 이용되고있다. 암세포 타원체 따라서, 3 차원의 효능을 증가 화합물을 생체에 영향을 미칠 가능성이 생체 내 종양에서 발견 된 것과 더 유사한 조건을 표시하는 구조이다. 그러나, 이러한 양상은 암 치료에 상당한 효과를 가질 수있는 약물 설계의 대상이되지 않은 잠재적으로 새로운 타겟들의 식별을 허용하지 않는다.
우리는 암 세포주 타원체에서 최대 7 일 동안 내구성 유전자 침묵 허용 siRNA의 기능 유전체학 접근 방식을 개발했다. siRNA를 화면이 수행되기 전에 최적화를 요구하는 프로토콜 몇몇 중요한 단계가있다. 대규모로 재현 가능한 타원체를 형성 할 수있는 능력은 필수적이다. 또한,ppropriate 형질 전환 조건은 엄격하게 최적화되어야한다. 우리는 적절한 비 타겟팅 여러 가지 형질 전환 시약을 시운전하고 화면을 시도하기 전에 컨트롤을 죽이는 것이 좋습니다. 우리는 MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 JIMT1은 siRNA를 형질 의무가 있었다 즉 BT474이 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주를 표시 할 수 있었다. 또한, 우리는 원리 증명 BT474의 타원체에 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 선별 데이터를 제공, HER2의 증폭 및 PIK3CA의 발암 돌연변이에 대한 자신의 의존성을 확인했다. 흥미롭게도, 전사 인자 FOXO3의 침묵은 회전 타원체 크기의 감소하지만 생존에 큰 영향 귀착되었다. FOXO3는 그들의 환경 (16)에 더 쉽게 적응할 수 있도록 암 세포의 신진 대사 능력을 변경하는 저산소증에 대한 반응을 조절하는 것으로 알려져있다. 이 ATP의 풍요 로움을 감지하는이 역할은 잠재적으로 세포 생존 판독을 방해 할 수세포 대사의 주요 제품 중 하나.
회전 타원체 소형화 관찰 지원에서는, 헬라에 FOXO3의 침묵은 종양 성장을 손상과 세포 사멸을 유도 17 이종 나타났다. 어떤 유전자 가양 초래할 수 그들의 3 차원 구조를 유지하기 위해 암 세포의 능력에 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 예를 들어, E-cadherin의의 최저은 BT474의 회전 타원체 구조의 용해 결과. 이것은 이전에 E-cadherin의 항체 (18)를 대상으로 사용하여보고했다. 모든 선별 플랫폼과 같이, 잠재적 인 타겟이 관찰 결과의 재현성을 평가하기 rescreened한다. 이 기술은 siRNA의 중재 유전자 최저, 즉 과도 특성에 제한이 있습니다. 침묵 지속 이상 칠일은 siRNA를 함께 달성하지 않았다.
이 방법의 장점은 여러 가지 다른 바이 옴과 결합 될 수 있다는⚻에 정해진 염료뿐만 아니라 구형 저산소증의 공간 정보를 제공 또는 아폽토시스를받은 셀을 모니터링, 예를 들면, 회전 타원체의 생존력을 평가 것과. 플레이트 판독기 스캔 비교적 빠르고 비파괴 때문에 또한, 구형의 크기 된 siRNA의 영향은 시간이 지남보다는 실험 종료 시점에서 평가 될 수있다. 사실, 우리는 현재 우리의 심사 파이프 라인 내에서 이러한 도로의 몇몇을 모색하고 있습니다. 새로운 종속성을 식별하기 위해 3 차원 배양을 이용하는 다른 방법은 대상 또는 단백질의 특정 패밀리의 넓은 범위를 억제하는 화학 라이브러리의 사용이다. 사실, Bitler 등. 난소 투명 세포 암종 19 ARID1A 상태 및 EZH2 저해제의 합성 사멸 작용을 확인하는 방법이 타겟을 이용했다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술의 발견은 organoid 배양 물 및 생체 내에서의 유전자 스크린의 개발이 허용되었다. 그러나, t그의 접근 방식은 적절한 동물 시설을 가지고에 의존하고 20 금지 비용이 될 수있다.
결론적으로, 우리는 우리가 프로토콜을 설명했다고 생각이 더 정확하게 모델 소설 암 대상 또는 설립 목표의 강력한 검증의 식별을 허용 생체 내 종양 미세 환경의 특징 인 산소와 영양소 그라디언트. 더욱이, 우리는 프로토콜 타원체를 형성하고, 따라서 통상적으로 높은 처리량의 siRNA 스크린의 암 연구 커뮤니티에서 사용할 수있는 세포주의 임의의 타입에 적용될 수있다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Materials
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
Referencias
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