Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

1. Crescimento de plantas de Arabidopsis eo stress tratamento Prepare 1 litro de meio Murashige e Skoog (MS) através da adição de 4,3 g de sal basal MS mistura, 10 g de sacarose, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) em água desionizada até 1 L, e ajustar o pH para 5,7 com hidróxido de potássio (KOH). Adiciona-se 6 g de phytoagar e autoclave durante 20 min a 120 ° C. Antes de solidificação, despeje o meio em placas de Petri redondos (diâmetro de 9 cm, altura 1,5 cm, com 20-25 mL de meio MS por placa). Permitir que as placas a secar durante ~ 1 h numa câmara de fluxo laminar antes de fechar as tampas. Coloque as sementes de Arabidopsis thaliana num tubo de ensaio de 1,5 mL para a esterilização da superfície por adição de 1 mL de 70% (v / v) de etanol contendo 0,02% (v / v) de Triton X-100 e agitando continuamente durante 5-10 min. Para cada genótipo / condição, preparar 10 Placas de Petri cada uma com ~ 100 – 150 mudas. Aguarde cerca de 10 s até que as sementes para liquidar ofundo do tubo, e, em seguida, desprezar o sobrenadante por pipetagem. Adicionar 1 ml de etanol a 100%, e agitar o tubo novamente por 10 min. Preparar a câmara de fluxo laminar, enquanto que as sementes são de esterilização. Pegue um pedaço de papel de filtro por amostra, dobre ao meio para facilitar a semeadura, e mergulhe-o em 100% de etanol na capa. Espere até que seque completamente. Note-se que o etanol a 100% é utilizado como se evapora mais rapidamente do que 70% de etanol. Transferir as sementes sobre o papel de filtro usando um pipetando 1 mL ponta da pipeta corte ~ 5 mm da extremidade fina. Deixe secar, o que deve levar cerca de 10 – 15 min. Semear ~ 100 – 150 sementes esterilizadas de forma uniforme em cada prato MS meio de Petri, e selar cada placa com fita cirúrgica. Armazenar as placas de cabeça para baixo a 4 ° C durante 2 – 4 d para incentivar e sincronizar germinação. sementes velhas pode ter de ficar mais tempo (até uma semana) a 4 ° C. Transferir as placas para uma câmara de cultura de tecidos vegetais e deixá-los de cabeça para cima.Deixar crescer as plantas para 8 d sob um ciclo de dia longo (16 horas 100? Mol · m – 2 · s – 1 luz, 8 horas de escuro) a 20 ° C. Para o tratamento de estresse, quando as plantas estão 8 d idade, na capela de fluxo, transferi-los a partir do meio agar, por gentilmente raspagem-los à mão usando luvas esterilizadas com etanol, para um frasco esterilizado de meio MS líquido contendo o estressor (por exemplo, , 200 mM de manitol). Evitar a transição de meio de agar. Cobrir a boca balão com uma folha esterilizada e permitir que as plantas a crescer sob as mesmas condições que no passo 1.8 para um adicional de 2 d num agitador orbital, com agitação suave (~ 100 rpm). 2. Fazendo uma proteína precursora por transcrição in vitro / tradução Nota: Este protocolo assume a utilização de Arabidopsis fotossistema I subunidade D precursor (pPsaD) como molde / pré-proteína, mas o método é compatível com os outros. <ol> Clonar a sequência codificadora (CDS) de pPsaD no local de clonagem múltipla (MCS) do vector pBluescript II SK (ou qualquer outro vector similar com um promotor de T7 a montante) 13. Purifica-se o plasmídeo (pBSK-pPsaD) usando um kit de isolamento de ADN e a sequência de verificar por sequenciação de ADN. NOTA: Todos estes passos empregam técnicas padrão de clonagem molecular. Determinar a concentração de ADN de plasmídeo pBSK-pPsaD utilizando um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 260 nm. Dilui-se o plasmídeo para uma concentração final de 10 ng / mL. Executar um 20 ul de PCR (para 35 ciclos) utilizando o plasmídeo diluída como molde. Preparar a reacção da seguinte forma: 2 ul de tampão 10 × polimerase, 2 ul de dNTPs 2 mM, 1 mL de 5 mM de iniciador directo M13 (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 uL de 5 mM de iniciador reverso de M13 (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 uL diluído plasmídeo pBSK-pPsaD, 1 U de Taq polimerase, e água destilada para perfazer o volume total de reacção até20 uL. Utilizar um programa de PCR padrão, como se segue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); e 72 ° C, 5 min. Executar 5 uL do produto de PCR em um 1% (w / v) em gel de agarose em tampão TAE (Tris-HCl, pH 7,6, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) para verificar a amplificação correcta do ADNc, e quantificar a relevante banda em relação aos padrões para confirmar a concentração. Armazenar o resto do produto à temperatura de -20 ° C para outras aplicações. Prepara-se uma reacção de 50 uL utilizando um sistema de reticulócitos de coelho lisado com base livre de células de transcrição / tradução compatíveis com o ADN de PCR, como se segue: 40? L de lisado de reticulócitos de o sistema de transcrição / tradução, 2,5 mL radiomarcado [35S] metionina, 11 uCi / ml (actividade específica:> 1000 Ci / mmol), água destilada estéril 2,5 mL, e 5 uL do produto de PCR pPsaD (100-800 ng). Cuidado: Use luvas, roupas de laboratório e glas de segurançases ao manusear material radioativo. Monitorar e descontaminar a superfície de trabalho e equipamentos. Eliminar todos os resíduos radioactivos numa recipiente de resíduos aprovado. Incubar a mistura reaccional durante 90 min num banho de água a 30 ° C. Parar a reacção colocando a amostra em gelo. Retirar 1 mL de reacção como uma amostra de ensaio (o mesmo volume também podem servir como um controle de entrada para o passo 5.7) para a verificação padrão em electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) seguido por autorradiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo. Um bom resultado é indicado pela observação de uma banda distinta e forte correspondente ao peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Armazenar o resto da reacção a -80 ° C para outras aplicações. 3. Isolamento cloroplastos Prepare as seguintes soluções de: Preparar tampão de isolamento cloroplastos (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, 10 mM de cloreto de magnésio(MgCl2), Etileno Glicol 10 mM de ácido tetra-acético (EGTA), ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA), bicarbonato de sódio 20 mM (NaHCO 3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) ; acertar a pH 8,0 com KOH. Preparar 2 L de 2x CIB, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração. Para fazer 1x CIB, diluir a 2x CIB 1: 1 com água destilada; este pode ser preparado de fresco no dia do experimento de isolamento dos cloroplastos. Prepare HEPES-tampão MgSO4 -Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, sulfato de magnésio 3 mM (MgSO 4), 0,3 M de sorbitol; acertar a pH 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH). Preparar 400 mL de tampão, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração. Realizar todos os seguintes procedimentos na sala de frio ou em gelo. Precool todas as soluções, dispositivos, equipamentos e rotores antes starting. Prepara-se uma gradiente de densidade contínuo através da mistura de 13 mL de Percoll, 13 mL de tampão 2x CIB, e 5 mg de glutationa em um tubo de centrífuga de 50 mL, e centrifugação da mistura a 43000 × g durante 30 min (freio desligado) a 4 ° C. Após centrifugação, o tubo lidar com o cuidado de evitar a perturbação do gradiente e mantê-lo em gelo para uso posterior. Transferir 100 mL de 1x CIB por genótipo / condição para uma proveta de 1 L. Retire as mudas a partir do meio líquido por depósito-los em uma peneira, e transferi-los para outro recipiente contendo CIB; em seguida, lavar o tecido com o CIB para remover qualquer meio líquido residual antes de a substituir com 100 mL de CIB fresco. Para homogeneização, use um total de 100 mL de 1x CIB por amostra em cinco rodadas consecutivas de homogeneização, cada rodada utilizando 20 mL de CIB fresco realizada em um copo de 50 mL. Para a primeira rodada de homogeneização, transferir o tecido da planta para o copo de 50 mL à mão, permitindo que otampão exploração anterior a escorrer por entre os dedos. Tente usar a maior parte do tecido na primeira rodada, mas certifique-se que está imerso com tampão; se isso não for possível, apresente o tecido restante no segundo turno. Coloque sonda do homogeneizador de tecidos no tecido e homogeneizar com dois impulsos de 1 – 2 s cada. Filtra-se o homogenato através de duas camadas de pano de filtração em um tubo de 250 ml de centrífuga por compressão gentil. Reter o filtrado, e transferir o tecido de volta para a proveta de 50 ml. Coloque um segundo 20 mL CIB alíquota para o copo de 50 mL, adicionando qualquer tecido restante não utilizado na primeira rodada de homogeneização, e repita os passos de homogeneização e filtração. Assim, repetir os passos 3.5 e 3.6, até que toda a 100 mL de CIB foi usado para cima (isto é, 5 alíquotas de 20 ml) e combinam-se os filtrados resultantes. Centrifugar o homogeneizado reunidas em 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C, e deitar forao sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento no sobrenadante residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Não ressuspender vigorosamente por pipetagem ou vórtex. Suavemente transferir o homogeneizado para o topo do gradiente de densidade contínuo pré-construídos, utilizando uma pipeta de Pasteur para aplicá-lo através da parede do tubo de recepção. Evitar perturbar o gradiente. Centrifugar em um rotor de balde a 7800 × g durante 10 min (freio desligado) a 4 ° C. NOTA: Duas bandas verde pode ser visto no gradiente após centrifugação: a banda inferior contem de cloroplastos intactos, e a banda superior contém cloroplastos quebradas. Descartar a banda superior por pipetagem, e, em seguida, transferir a banda inferior com uma pipeta de Pasteur, para um novo tubo de centrífuga de 50 ml, mantendo um volume de até 8 mL por gradiente. Adicionar ~ 25 mL de 1x tampão HMS para dentro do tubo e inverter o tubo, duas vezes tO lavar o Percoll a partir dos cloroplastos. Colocar o tubo de novo no rotor de balde e centrifugar a 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em cloroplastos HMS residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Adicionar um adicional de 100 – 300 ul de HMS, se necessário (com base no tamanho do grânulo e a contagem no ponto 4), mas não tente para diluir a amostra muito. Mantenha os cloroplastos no gelo. Cada vez antes que os cloroplastos são usados ​​para aplicações a jusante, agite o tubo para ressuspender-los. Sempre use uma ponta de corte pipeta (com um pore ampliado) para transferir os cloroplastos. 4. Análise do Rendimento e intacto dos cloroplastos Adicionar 5 uL de cloroplastos isolados de 495 ul de tampão de 1x HMS em um tubo de 1,5 ml, e, em seguida, misturar suavemente por inversão do tubo para obter uma diluição de 1: 100. Place uma tampa de vidro na parte superior da câmara de contagem de hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 – 60 mL da suspensão diluída de cloroplasto para dentro do intervalo entre o vidro de cobertura e a câmara de contagem. Usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X ou 20X, cloroplastos intactos olhar em volta e luminosos e estão rodeadas por um halo de luz. NOTA: Sob o microscópio, há uma área de 2 1 mM de contagem com 25 quadrados grandes, cada uma contendo 16 quadrados pequenos no centro da câmara de contagem. Contar o número de cloroplastos em 10 grandes praças. O número de cloroplastos por grande praça deverá média entre 10 e 30. Se for muito poucos ou muitos cloroplastos estão presentes, ajustar o fator de diluição (passo 4.1 acima) nesse sentido, e repita o procedimento. Calcular o número de cloroplasto por mL (concentração) como se segue: N (o número médio de cloroplastos por quadrado grande calculado no passo 4.3) x 25 (número total de quadrados grandes) × 100 (o factor de diluição) x 10 4 (fator de escala para expressar os dados por 1 ml, uma vez que o volume acima dos 25 quadrados é de 0,1 mm 3). Calcular o rendimento real de cloroplastos multiplicando a concentração por o volume de suspensão de cloroplastos obtido no passo 3.12. Normalmente, mais de 50 × 10 6 cloroplastos pode ser obtido. 5. cloroplastos Import Protein Prepare as seguintes soluções de: Preparar tampão 10x HMS: HEPES 500 mM, MgSO 4 30 mM e sorbitol 3,0 M; acertar a pH 8,0 com NaOH. Preparar 50 ml deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e a 4 ° C para armazenagem de curta duração. Prepare Import tampão de paragem: EDTA 50 mM dissolvido em tampão 1x HMS. Prepare 50 mL deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C. Prepare 2x tampão de carga de proteína: Tris-HCl a 60, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) de SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Adicione 50 ml e armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 100 mL de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 uL de tampão. Para executar um tempo de curso com 3 pontos de tempo, preparar 3 tubos contendo cada uma alíquota de 130 mL de tampão de paragem de importação, e deixá-los no gelo. Prepare uma reação de importação de 450 mL em um tubo de 2 mL (por genótipo / condição). Descongelar todos os ingredientes, imediatamente antes de usar. Para uma reacção de importação, geralmente usam 10 × 10 6 cloroplastos num volume mL; Por exemplo, se a concentração do cloroplasto é de 2,5 x 10 8 / mL, usar 40 ul de suspensão de cloroplastos. Três pontos de tempo terá 3 × Um mL (ou seja, 120 mL em nosso exemplo). Misturar os componentes reacções em gelo na seguinte ordem: água destilada (para perfazer o volume total de 600 mL), tampão B pL de 10x HMS (em que B = [600-3 × A] / 10; isto é, 48 no nosso exemplo), 12 mL1M de ácido glucónico (sal de potássio), 6 mL de 1 M NaHCO 3, 6 mL de 20% (w / v) BSA, 30 ul de adenosina 100 mM de 5'-trifosfato de sal de magnésio (MgATP), 24 uL de metionina 250 mM (não marcado radioactivamente ), e 30 mL precursor da proteína. Imediatamente antes de iniciar a reação de importação, adicionar 3 × Um mL de cloroplastos e misture delicadamente tocando no tubo. Incubar o tubo de reacção a 25 ° C num banho de água a menos de 100 umol · · m – 2 s – 1 luz. agite ocasionalmente os tubos para voltar a suspender cloroplastos. Para realizar um tempo de curso, retirar 130 mL alíquotas a partir da reação no momento de pontos necessários dentro da faixa linear de importação, o que para pPsaD é de até ~ 12 min (4, 8 e 12 mínimo de pontos de tempo são adequados nesse caso). O período de intervalo linear pode variar para diferentes proteínas 14. Assim, sugere-se a pré-proteina testar cada indivíduo antes para optimizar tEle aponta tempo. Imediatamente após a retirada, transferir cada alíquota de 130 ul a um tubo de tampão de paragem de importação gelada, misture delicadamente tocando no tubo, e manter todos os tubos em gelo até que o tempo de curso foi concluído. Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 12.000 x g numa microcentrífuga, descartar o sobrenadante por pipetagem, e peletes de ressuspender em 15 ul de 2x tampão de carga de proteína por vórtice. Analisar todas as amostras mais o controlo de entrada pPsaD (contendo pPsaD equivalente a 10% da quantidade adicionada a cada reacção de importação, a partir do passo 2.7) pelo padrão de SDS-PAGE e auto-radiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo 15. Usar a imagem de software de análise de quantificar e analisar os resultados. Para fornecer uma indicação da eficiência da importação, a quantidade de proteína importada em diferentes genótipos / condições pode ser avaliado medindo-se a radioactividade associada a cada banda madura.