Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen und die Stress-Behandlung Vorbereitung 1 l Murashige und Skoog (MS) Medium durch Zugabe von 4,3 g MS Basal Salzmischung, 10 g Sucrose, 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) zu entionisiertem Wasser bis zu 1 l und Einstellen der pH-Wert auf 5,7 mit Kaliumhydroxid (KOH). Hinzufügen 6 g Phytoagar und Autoklaven für 20 min bei 120 ° C. Vor der Verfestigung, gießen Sie das Medium in runde Petrischalen (Durchmesser 9 cm, Höhe 1,5 cm, mit 20 bis 25 ml MS-Medium pro Platte). Erlauben die Platten für ca. 1 h in einer laminaren Strömungshaube trocknen, bevor der Deckel geschlossen wird. Platzieren Arabidopsis thaliana Samen in ein 1,5 ml Reagenzglas zur Oberflächensterilisation durch Zugabe von 1 ml 70% (v / v) Ethanol , enthaltend 0,02% (v / v) Triton X-100 und kontinuierlich für 5-10 min Schütteln. Für jeden Genotyp / Zustand, bereiten 10 Petrischalen mit jeweils tragenden ~ 100-150 Sämlinge. Warten Sie etwa 10 Sekunden, bis die Samen auf die abrechnenBoden der Röhre, und dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. 1 ml 100% Ethanol, und schütteln Sie das Tube wieder für 10 min. Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube, während die Samen Sterilisieren werden. Nehmen Sie ein Stück Filterpapier pro Probe, falten Sie es in der Hälfte der Aussaat zu erleichtern, und genießen Sie es in 100% Ethanol in der Haube. Warten Sie, bis es vollständig austrocknet. Man beachte, dass 100% Ethanol verwendet, da es schneller als 70% Ethanol verdampft. Übertragen Sie die Samen auf das Filterpapier durch Pipettieren einer 1 ml Pipettenspitze Schnitt ~ 5 mm von dem feinen Ende verwendet wird. Trocknen lassen, was etwa 10 nehmen sollte – 15 min. Sow ~ 100-150 sterilisierten Samen gleichmäßig auf jedem MS-Medium Petri-Platte und Dichtung jede Platte mit chirurgischen Band. Lagern Sie die Platten den Kopf bei 4 ° C für 2 – 4 d zu fördern und zu synchronisieren Keimung. Alte Samen müssen möglicherweise länger bleiben (bis zu einer Woche) bei 4 ° C. Übertragen Sie die Platten auf eine Pflanze Gewebekulturkammer und lassen sie den Kopf nach oben.Wachsen die Pflanzen für 8 d unter einem langfris – Tage – Zyklus (16 h 100 & mgr; mol · m – 2 · s – 1 Licht, 8 Stunden Dunkelheit) bei 20 ° C. Für Stress – Behandlung, wenn die Pflanzen 8 d alt sind, in der Flow – Haube, übertragen sie aus dem Agar – Medium, indem sie sanft aus der Hand tragen Ethanol-sterilisierten Handschuhe, in eine sterilisierte Flasche flüssigem MS – Medium mit dem Stressor Schaben (zB , 200 mM Mannit). Vermeiden Sie über Agar-Medium trägt. Decken Sie den Kolben Mund mit sterilisiertem Folie ab und lassen die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.8 für weitere 2 d auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 Umdrehungen pro Minute) zu wachsen. 2. Herstellung eines Precursor Protein durch in vitro – Transkription / Translation Hinweis: Dieses Protokoll nimmt die Verwendung von Arabidopsis Photosystem I Untereinheit D-Vorläufer (pPsaD) als Templat / Präprotein, aber das Verfahren ist kompatibel mit anderen. <ol> Klon der kodierenden Sequenz (CDS) von pPsaD in die multiple Klonierungsstelle (MCS) des pBluescript II SK – Vektor (oder irgendeinem anderen ähnlichen Vektor mit einem vorgeschalteten T7 – Promotor) 13. Man reinige das Plasmid (pBSK-pPsaD) eine DNA-Isolation-Kit und die Sequenz durch DNA-Sequenzierung zu überprüfen. HINWEIS: Alle diese Schritte verwenden Standard molekulare Klonierungstechniken. Bestimmen Sie die pBSK-pPsaD Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer eingestellt unter Verwendung von Absorption bei 260 nm zu messen. Verdünne das Plasmid auf eine Endkonzentration von 10 ng / & mgr; l. Führen Sie einen 20 & mgr; l PCR (35 Zyklen), um das verdünnte Plasmid als Matrize. Bereiten Sie die Reaktion wie folgt: 2 & mgr; l 10 × Polymerase-Puffer, 2 & mgr; l 2 mM dNTPs, 1 & mgr; l 5 mM M13 Vorwärtsprimer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 & mgr; l 5 mM M13 Umkehrprimer (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 ul pBSK-pPsaD Plasmid verdünnt, 1 U Taq-Polymerase und destilliertes Wasser, um das Gesamtreaktionsvolumen von bis zu20 & mgr; l. Verwenden Sie ein Standard-PCR-Programm wie folgt: 95 ° C, 5 min; 35 Zyklen von [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); und 72 ° C, 5 min. Versuch 5 & mgr; l des PCR-Produkts auf einem 1% (w / v) Agarosegel in TAE-Puffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA) korrekten Amplifikation der cDNA zu verifizieren und zu quantifizieren, die relevante Band in Bezug auf Standards, um die Konzentration zu bestätigen. Lagern Sie den Rest des Produkts bei -20 ° C für weitere Anwendungen. Bereiten einer 50 ul Reaktion eines Kaninchen – Retikulozyten – Lysat basierend zellfreien Transkriptions- / Translationssystem kompatibel mit PCR DNA unter Verwendung von wie folgt: 40 ul Reticulocytenlysat vom Transkriptions- / Translationssystem, 2,5 & mgr; l radioaktiv markiertem [35 S] Methionin, 11 uCi / ml (spezifische Aktivität:> 1000 Ci / mmol), 2,5 & mgr; l sterilem destilliertem Wasser und 5 ul pPsaD PCR-Produkt (100-800 ng). Achtung: Tragen Sie Handschuhe, Laborkleidung und Schutzglasses beim Umgang mit radioaktivem Material. Überwachen und die Arbeitsfläche und Geräte dekontaminieren. Entsorgen Sie alle radioaktiven Abfälle in einem zugelassenen Abfallbehälter. Inkubieren der Reaktion für 90 min in einem 30 ° C Wasserbad. Die Reaktion durch die Probe auf Eis gestellt. Entfernen, um 1 & mgr; l der Reaktion als Testprobe (das gleiche Volumen kann auch dazu dienen als Eingangssteuerung für Schritt 5.7) zur Überprüfung auf Standard Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor-Bildgebung. Ein gutes Ergebnis wird durch die Beobachtung einer deutlichen und starke Bande entsprechend dem Molekulargewicht von pPsaD (~ 23 kD) angegeben. Lagern Sie den Rest der Reaktion bei -80 ° C für weitere Anwendungen. 3. Chloroplasten Isolation Die folgenden Stammlösungen: Bereiten Chloroplast Isolierungspuffer (CIB, 2x): 0,6 M Sorbit, 10 mM Magnesiumchlorid(MgCl 2), 10 mM Ethylenglykol – tetraessigsäure (EGTA), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 20 mM Natriumbicarbonat (NaHCO 3), 40 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) ; auf pH 8,0 mit KOH eingestellt werden. Bereiten Sie 2 l 2x CIB, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. Um 1x CIB machen verdünnen 2x CIB 1: 1 mit destilliertem Wasser; dies kann frisch am Tag der Chloroplasten-Isolierung Experiment hergestellt werden. Bereiten HEPES-Puffer MgSO 4 -Sorbit (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM Magnesiumsulfat (MgSO 4), 0,3 M Sorbitol; Einstellen auf pH 8,0 mit Natriumhydroxid (NaOH). Bereiten Sie 400 ml Puffer, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. Führen Sie alle folgenden Verfahren im Kühlraum oder auf Eis. Vorzukühlen alle Lösungen, Geräten, Ausrüstung und Rotoren vor starting. Vorbereiten eines kontinuierlichen Dichtegradienten durch Mischen von 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB Puffer und 5 mg Glutathion in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren der Mischung bei 43.000 × g für 30 min (Brems off) bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren behandeln das Rohr mit Sorgfalt die Steigung nicht zu stören und halten Sie sie auf Eis für die spätere Verwendung. Übertragen Sie 100 ml 1x CIB pro Genotyp / Zustand in einen 1-Liter-Becher. Entfernen Sie die Sämlinge aus dem flüssigen Medium, indem sie in ein Sieb kippen und übertragen diese in einen anderen CIB enthaltenden Becher; dann spülen Sie das Gewebe mit dem CIB restliche flüssige Medium zu entfernen, bevor es mit 100 ml frischem CIB zu ersetzen. Zur Homogenisierung mit insgesamt 100 ml 1x CIB pro Probe in fünf aufeinander folgenden Runden der Homogenisierung verwenden, jeder Runde unter Verwendung von 20 ml frischem CIB in einem Becherglas 50 ml gehalten. Für die erste Runde der Homogenisierung, übertragen das Pflanzengewebe, in das 50 ml-Becherglas von Hand, so dass dervorherigen Haltepuffer durch die Finger zu entleeren. Versuchen Sie den größten Teil des Gewebes in der ersten Runde zu verwenden, aber stellen Sie sicher, dass es mit Puffer eingetaucht ist; wenn dies nicht möglich ist, stellen die verbleibenden nicht verwendeten Gewebe in der zweiten Runde. Legen Sonde des Gewebes Homogenisator in das Gewebe und homogenisieren mit zwei Impulsen von 1 bis 2 s je. Filtern des Homogenats durch zwei Schichten von Filtertuch in einen 250-ml-Zentrifugenröhrchen durch sanftes Quetschen. Bewahren Sie das Filtrat, und übertragen das Gewebe zurück in die 50-ml-Becher. Legen Sie eine zweite 20 ml CIB aliquoten in den 50-ml-Becherglas, das Hinzufügen alle verbleibenden Gewebe nicht in der ersten Runde der Homogenisierung verwendet, und wiederholen Sie die Homogenisierung und Filtrationsschritte. Somit wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 , bis alle der 100 ml CIB verbraucht ist (dh 5 Aliquots von 20 ml), und die daraus resultierenden Filtrate kombinieren. Zentrifugieren Sie die gepoolten Homogenats bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C und abgießender Überstand unmittelbar nach Beendigung der Zentrifugation, dabei nicht um das Pellet zu stören. Das Pellet im Restüberstand in der Röhre nach links, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Nicht heftig durch Pipettieren oder Vortexen resuspendieren. übertragen Sie vorsichtig das Homogenisat auf der Oberseite der vorgefertigten Gradienten kontinuierliche Dichte, mit einer Pasteurpipette es über die Wand des Aufnahmerohr anzuwenden. Vermeiden Sie den Gradienten zu stören. Zentrifuge in einem Schwenkbecherrotor bei 7.800 × g für 10 min (Brems off) bei 4 ° C. HINWEIS: Zwei grüne Bänder in der Steigung nach dem Zentrifugieren gesehen werden kann: das untere Band intakt Chloroplasten enthält, und das obere Band gebrochene Chloroplasten enthält. Entsorgen Sie die Top-Band durch Pipettieren und dann übertragen das untere Band mit einer Pasteur-Pipette in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen, ein Volumen von bis zu 8 ml pro Steigung zu halten. In ~ 25 ml 1x HMS-Puffer in das Rohr und invertieren zweimal das Rohr to waschen Sie die Percoll aus den Chloroplasten. Das Röhrchen wird erneut in die Schwingeimerrotor und Zentrifuge bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C. Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Chloroplasten-Pellet in den Rest HMS resuspendieren in der Röhre gelassen, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Fügen Sie eine weitere 100 bis 300 & mgr; l von HMS, falls erforderlich (basierend auf der Größe des Pellets und der Auszählung in Abschnitt 4), aber versuchen Sie nicht, um die Probe zu viel zu verdünnen. Halten Sie die Chloroplasten auf Eis. Jedes Mal, bevor die Chloroplasten für Downstream-Anwendungen verwendet werden, schütteln Sie das Röhrchen sie wieder zu suspendieren. Verwenden Sie immer einen Schnitt Pipettenspitze (mit einem vergrößerten Pore) die Chloroplasten zu übertragen. 4. Analyse der Ausbeute und Intakt von Chloroplasten In 5 ul isoliert Chloroplasten bis 495 & mgr; l 1x HMS-Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen, und dann vorsichtig mischen, indem das Röhrchen Invertieren einer 1 zu erhalten: 100 Verdünnung. Place ein Deckglas auf der Oberseite der Zählkammer des Haemocytometers. Langsam Pipette ~ 40 – 60 & mgr; l der verdünnten Chloroplasten-Suspension in den Spalt zwischen dem Deckglas und der Zählkammer. Mit Hilfe eines Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher oder 20x-Objektiv, suchen intakte Chloroplasten rund und hell und von einem Lichtkreis umgeben. HINWEIS: Unter dem Mikroskop gibt es eine 1 mm 2 Zählfläche mit 25 großen Quadraten, die jeweils 16 kleine Quadrate in der Mitte der Zählkammer. Zählen Sie die Anzahl der Chloroplasten in 10 großen Plätzen. Die Zahl der Chloroplasten pro großen Platz sollte im Durchschnitt zwischen 10 und 30. Wenn zu wenige oder zu viele Chloroplasten vorhanden sind, den Verdünnungsfaktor (Schritt 4.1 oben) entsprechend anpassen, und wiederholen Sie den Vorgang. Berechnen der Anzahl von Chloroplasten pro ml (Konzentration) wie folgt: n (die durchschnittliche Anzahl der pro Chloroplasten großen Platz berechnet in Schritt 4.3) × 25 (Gesamtzahl der großen Quadraten) × 100 (Verdünnungsfaktor) × 10 4 (Skalierungsfaktordaten pro 1 mL auszudrücken, da das Volumen oberhalb der 25 Quadrate 0,1 mm 3). Berechnen Sie die tatsächliche Ausbeute von Chloroplasten durch die Konzentration durch das Volumen der Chloroplasten-Suspension in Schritt 3.12 erhalten multipliziert wird. Normalerweise können mehr als 50 × 10 6 Chloroplasten erhalten werden. 5. Chloroplasten-Protein Import Die folgenden Stammlösungen: Bereiten 10x HMS – Puffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 und 3,0 M Sorbitol; auf pH 8,0 mit NaOH einstellen. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung und bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. Bereiten Import Anschlagpuffer: 50 mM EDTA, gelöst in 1x HMS-Puffer. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C. Bereiten 2x Protein-Ladepuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) Glycerin, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) Bromphenolblau. Machen Sie 50 ml, und lagern bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, 100 & mgr; l von 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) bis 900 & mgr; l Puffer. Um einen zeitlichen Verlauf mit drei Zeitpunkten ausgeführt werden, bereiten 3 Röhrchen jeweils ein 130-ul-Aliquot von Einfuhranschlagpuffer enthalten, und lassen Sie sie auf Eis. Bereiten Sie eine 450 & mgr; l Import Reaktion in einem 2-ml-Röhrchen (pro Genotyp / Zustand). Tauen Sie alle kurz vor Zutaten zu verwenden. Für eine Importreaktion verwenden in der Regel von 10 × 10 6 Chloroplasten in A & mgr; l Volumen; Wenn beispielsweise die Chloroplasten – Konzentration 2,5 × 10 8 / ml, 40 ul verwenden Chloroplasten Suspension. Drei Zeitpunkte müssen 3 × A & mgr; l (dh 120 & mgr; l in unserem Beispiel). Mischen Sie die Reaktionen Komponenten auf Eis in der folgenden Reihenfolge: destilliertes Wasser (bis das Gesamtvolumen 600 & mgr; l zu machen), B ul 10x HMS – Puffer (wobei B = [600-3 × A] / 10, dh 48 in unserem Beispiel), 12 ul1 M Gluconsäure (Kaliumsalz), 6 & mgr; l 1 M NaHCO 3, 6 & mgr; l 20% (w / v) BSA, 30 & mgr; l 100 mM Adenosin – 5'-Triphosphat – Magnesiumsalz (MgATP), 24 & mgr; l 250 mM Methionin (nicht radiomarkiert ) und 30 & mgr; l-Vorläuferprotein. Unmittelbar vor dem Import Reaktion starten, fügen Sie 3 × A & mgr; l von Chloroplasten und mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen. Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen bei 25 ° C in einem Wasserbad unter 100 & mgr; mol · m – 2 · s – 1 Licht. Gelegentlich Flick die Rohre Chloroplasten zu suspendieren. Um einen Zeitverlauf führen, zurückziehen 130 & mgr; l-Aliquots aus der Reaktion bei den erforderlichen Zeitpunkten im linearen Bereich der Einfuhr, die für pPsaD bis zu ~ 12 min (4-, 8- und 12-min Zeitpunkten geeignet sind in diesem Fall). Der lineare Bereich Zeitraum kann für verschiedene Proteine 14 variieren. So wird vorgeschlagen, vor jeder einzelnen Präprotein zu testen t zu optimierener Zeitpunkten. Unmittelbar nach dem Rückzug, übertragen jede 130-ul-Aliquot in ein Röhrchen eiskaltem Import Anschlagpuffer, mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen, und alle Röhrchen auf Eis zu halten, bis die Zeit-Kurs abgeschlossen ist. Zentrifugieren Sie alle Proben für 30 s bei 12.000 × g in einer Mikro, entsorgen Sie die Überstände durch Pipettieren und Resuspension Pellets in 15 ul 2x Protein-Ladepuffer durch Vortexen. Analyse aller Proben sowie die pPsaD Eingangskontrolle (mit pPsaD äquivalent zu 10% der Menge zugegeben , die jedem Importreaktion aus Schritt 2.7) durch Standard – SDS-PAGE und Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor – Bild 15. Verwenden Sie die Bildanalyse-Software zu quantifizieren und die Ergebnisse zu analysieren. Um eine Anzeige der Importeffizienz bieten, kann die Menge des importierten Proteins in verschiedenen Genotypen / Bedingungen durch Messung der Radioaktivität mit jedem reifen Band zugeordnet bewertet werden.