تحليل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة من النباتات وشدد
Summary
نحن هنا وصف طريقة جديدة لدراسة استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء المعزولة تحت الضغط. فإن هذه الطريقة سريعة ومباشرة، ويمكن تطبيقها على دراسة النتائج المترتبة على ظروف الإجهاد مختلفة لاستيراد البروتين بلاستيدات الخضراء، والآليات التنظيمية ذات الصلة.
Abstract
البلاستيدات الخضراء هي عضيات مع العديد من الأدوار الحيوية في النباتات، والتي تشمل الضوئي فحسب، بل العديد من التمثيل الغذائي وغيرها من الوظائف الإشارة. وعلاوة على ذلك، البلاستيدات الخضراء هي الحاسمة للاستجابة النبات لمختلف الضغوط غير الحيوية، مثل الملوحة والضغط الاسموزي. قد يحتوي على بلاستيدات الخضراء تصل الى ~ 3000 البروتينات المختلفة، وبعضها المشفرة بواسطة الجينوم الخاص بها. ومع ذلك، يتم ترميز معظم البروتينات بلاستيدات الخضراء في النواة وتوليفها في العصارة الخلوية، وتحتاج إلى يمكن استيرادها إلى بلاستيدات الخضراء من خلال translocons في الأغشية المغلف بلاستيدات هذه البروتينات. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن استيراد البروتين بلاستيدات الخضراء يمكن تنظيم بنشاط عن الإجهاد. للتحقيق كيميائيا مثل هذا التنظيم الاستيراد البروتين تحت ظروف الإجهاد، قمنا بتطوير الطريقة الموصوفة هنا كإجراء سريع ومباشر التي يمكن أن يتحقق بسهولة في أي مختبر. في هذه الطريقة، وتزرع النباتات تحت تكييف عادينانوثانية ثم تتعرض لظروف عصيبة في ثقافة السائل. يتم جمع المواد النباتية، ومن ثم يتم الافراج البلاستيدات الخضراء من التجانس. يتم فصل جناسة الخام عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة، مما عزل البلاستيدات الخضراء سليمة. ويتم تقييم العائد بلاستيدات الخضراء التي كتبها العد، ويتم فحص intactness بلاستيدات الخضراء تحت المجهر. لفحوصات استيراد البروتين، يتم تحضين البلاستيدات الخضراء النقاء مع 35 S رديولبلد في المختبر ترجمة البروتينات السلائف، وأجرت تجارب الوقت طبعا لتمكين مقارنات لأسعار الواردات بين التراكيب الوراثية تحت ظروف الإجهاد. نقدم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة التي تظهر أن معدل استيراد البروتين في البلاستيدات الخضراء من المسخ التنظيمي يتم تبديل وجه التحديد تحت ظروف الإجهاد التناضحي.
Introduction
البلاستيدات الخضراء هي عضيات وفيرة جدا أن توجد في الأنسجة الخضراء من النباتات. وهي معروفة لدورها الحاسم في عملية التمثيل الضوئي، وهي العملية التي تستخدم الطاقة الضوئية لتحويل ثاني أكسيد الكربون إلى سكر، وبالتالي دعم الحياة كلها تقريبا على وجه الأرض 1. وبالإضافة إلى ذلك، البلاستيدات الخضراء (والأسرة أوسع من العضيات المتعلقة تسمى البلاستيدات) تلعب العديد من الأدوار الحيوية الأخرى في النباتات، بما في ذلك التركيب الحيوي من الأحماض الأمينية، والدهون، والأصباغ، والاستشعار من إشارات البيئية مثل الجاذبية والتحدي الممرض. التمثيل الضوئي يولد أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) بوصفه من المنتجات، والتي لها أدوار مفيدة في ظل ظروف معينة، ولكن إذا يفرط يمكن أن يسبب آثارا ضارة أو حتى قاتلة. الإفراط في الإنتاج ريوس يتم الترويج بشكل خاص من الظروف البيئية الضارة، وبالتالي البلاستيدات الخضراء ترتبط ارتباطا وثيقا الردود على الضغوط غير الحيوية، مثل الملوحة والضغط الاسموزي 2.
الفصلloroplasts لها بنية معقدة. ويحيط كل بلاستيدات الخضراء من قبل الطبقة الخارجية مزدوجة غشاء يسمى المغلف، والذي يتألف من الأغشية الداخلية والخارجية. داخليا، هناك نظام غشاء آخر يدعى ثايلاكويد، حيث ردود الفعل الخفيفة الضوئي تحدث. بين النظم غشاء اثنين وجود مكالمة مقصورة المائية سدى، التي تشارك في تثبيت الكربون. قد يحتوي على بلاستيدات الخضراء تصل الى ~ 3000 البروتينات المختلفة، ويتم تصنيعه الغالبية العظمى من هذه البروتينات في العصارة الخلوية في شكل السلائف وتحتاج إلى يمكن استيرادها إلى عضية من خلال translocons البروتين مكرسة في الأغشية المغلف 1. ومن المثير للاهتمام، وقد أشارت الأبحاث الحديثة أن بروتين بلاستيدات الخضراء استيراد وينظم بنشاط، وحتى لا يكون قادرا على ممارسة مستوى هام من السيطرة على بروتيوم بلاستيدات الخضراء. على سبيل المثال، أفيد في عام 2015 أن بروتين استيراد يمكن أن تستجيب للإجهاد اللاأحيائي من خلال التنظيم المباشر من وفرة من الالبريد translocon في الغشاء المغلف الخارجي من البلاستيدات الخضراء (TOC) من قبل النظام اليوبيكويتين-proteasome و3.
باستخدام البلاستيدات الخضراء النقاء وفي المختبر توليفها البروتينات السلائف، استيراد البروتين يمكن أن يعاد تشكيلها في المختبر 4،5. وهكذا، في المختبر أساليب يمكن استخدامها لتقييم معدلات الاستيراد في مختلف محطات متحولة 6، والتي كانت مقاربة نقدية لتحليل مكونات المفترضة لاستيراد الآلات والبروتين لاكتشاف الآليات الكامنة وراء استيراد البروتين ولائحته التنفيذية. وعلاوة على ذلك، البلاستيدات الخضراء يمكن معالجتها مع مزيد من تجزئة أو الهضم البروتيني، التالية في المختبر الاستيراد، والتي يمكن أن تسهل الدراسات على توطين شبه organellar وطوبولوجيا من البروتينات بلاستيدات الخضراء 7،8.
لدراسة تنظيم استيراد البروتين عن الإجهاد، قمنا بتعديل دينا الروتيني طريقة بلاستيدات الخضراء العزلة كما سنقوم بشرحهنا. الأهم من ذلك، تم عزل البلاستيدات الخضراء من النباتات التي قد نمت على معيار Murashige وسكوغ (MS) أجار متوسطة لمدة 8 أيام، ثم نقل إلى متوسطة MS السائل تستكمل مع الإجهاد، وتوفير ومعالجة الإجهاد قصيرة نسبيا تسيطر عليها. العائد والكفاءة من البلاستيدات الخضراء المعزولة من هذه النباتات المعالجة الإجهاد متوافقة مع المصب في البروتين المختبر استيراد فحص 3. بالإضافة إلى بروتوكول العزلة بلاستيدات الخضراء، نقدم طريقة روتينية لدينا في المختبر البروتين الاستيراد، الذي أثبت أن تكون قوية، ويستخدم على نطاق واسع 3،9-12.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأظهرت لنا مؤخرا أن بلاستيدات الخضراء استيراد البروتين يمكن تنظيم بنشاط عن الإجهاد، وهو أمر حاسم لوظيفة بلاستيدات الخضراء والنباتات البقاء على قيد الحياة 3. في هذه الدراسة، لرصد مثل هذا التنظيم، علينا تعديل عزلتنا بلاستيدات الخضراء وفي إجراءات فحص واردات المختبر من أجل تمكين تقييم القدرة على الاستيراد من النباتات التي تزرع تحت ظروف الإجهاد. أشارت النتائج دورا هاما لSP1 في بلاستيدات الخضراء تنظيم بروتين الاستيراد.
التقليدية في المختبر فحوصات استيراد استخدام النباتات التي تزرع على MS القياسية أجار المتوسطة 6،17،18. في حالة متحولة SP1 الموصوفة هنا، لم هذه المقايسات التقليدية لا تكشف عن أي اختلافات في البروتين استيراد نسبة إلى WT 3. ومع ذلك، تبين دور SP1 في تنظيم استيراد البروتين بشكل واضح عندما يتم تقييم استيراد البروتين تحت ظروف الإجهاد باستخدام الأساليب المذكورة هنا (الشكل 1). في حين أنه معبد المنعم يوسف لا يكون من الممكن مقارنة مباشرة استيراد البيانات من فحص ظروف الإجهاد مع تلك التي تم الحصول عليها من المقايسات التقليدية (مثل أساليب تستخدم النباتات التي تزرع في ثقافة السائل وعلى وسط أجار، على التوالي)، مقارنات بين ظروف الإجهاد وعدم الإجهاد ممكنة شريطة أن تزرع النباتات كلها في نفس مستنبت السائل، مع أو من دون ضغوطات.
مقارنة مع علاج الضغط على وسط أجار، ثقافة السائل هو أكثر ملاءمة لعلاج أعداد كبيرة من النباتات اللازمة لفحوصات في المختبر الاستيراد. وعلاوة على ذلك، فإنه يسهل التطبيق الموحد للالضغوطات لجميع النباتات، وهو أمر مهم بشكل خاص لعلاج الإجهاد على المدى القصير. وقد تم تطبيق الطريقة المعروضة هنا لدراسة الضغط الاسموزي باستخدام العلاج مانيتول، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة واسعة من الضغوط الأخرى؛ على سبيل المثال، الإجهاد الملحي على المدى القصير والاكسدة، التي الضغوطات المقابلة يمكن به تطبق بالمثل عبر المتوسط MS السائل. لأنواع أخرى من الضغوط، فإننا نقترح على درجة من الإجهاد هو الأمثل لأول مرة. مفرط قد يكون العلاج شديدة آثار سلبية على المحصول و / أو الكفاءة الواردات من العضيات معزولة.
هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول الذي ينبغي للمرء أن تولي اهتماما خاصا، كما هو موضح أدناه.
تركيز أجار الأمثل على المدى المتوسط MS يمكن أن تختلف (0،6-0،9٪، ث / ت) اعتمادا على الشركة المصنعة. وبالتالي، فمن المستحسن أن تجريبيا تحسين تركيز أجار قبل بدء التجارب. لا ينبغي أن يكون وسيلة لينة بحيث تلتزم الأنسجة في خطوة حصاد (الخطوة 1.9)، لا ينبغي أن يكون من الصعب جدا أن يوقف نمو جذور النباتات. ويمكن أيضا أن تركيز السكروز تعديلها وفقا للنباتات المستخدمة. عند العمل مع المسوخ المرضى بشكل خاص، MS المتوسطة تستكمل مع 2-3٪ (ث / ت) السكروز قد تساعد النباتات على النمو بشكل أفضل. عندما التطبيقالكذب العلاجات الإجهاد، وأنها ليست جيدة لنقل المصانع القديمة جدا من الوسط السائل (على سبيل المثال،> 14 يوما). وذلك لأن جذور الأكثر تقدما من أقدم النباتات التي تضررت أكثر سهولة أثناء بالتحويل.
وفيما يتعلق بنظام النسخ / الترجمة، وهناك 2 النظم الرئيسية: تلك التي تقوم على جرثومة القمح، وتلك القائمة على الخلايا الشبكية أرنب. قد تستخدم هذه المجموعات قوالب مختلفة، مثل البلازميدات خطي، البلازميدات unlinearized، أو المنتجات PCR. مجموعات هي أيضا محددة لالمروجين T3، T7، وSP6. لاحظ أن عدة نوصي هنا لا يصلح إلا للاستخدام مع منتجات PCR والمروج T7. ومع ذلك، لأسباب غير معروفة، وبعض preproteins رديولبلد المصنوع من هذا النظام قد لا تعمل بكفاءة في فحص الواردات. في مثل هذه الحالات، يمكن للمرء النظر في محاولة لجرثومة القمح استخراج النظام أو نظام الخلايا الشبكية المحللة يعني لقوالب البلازميد. يمكن للمرء أيضا تحسين النتيجة من النسخ / ترجمة إعادةالعمل عن طريق تعديل ظروف التفاعل وفقا لكتيب الشركة المصنعة.
من المهم أن تبدأ العزلة بلاستيدات الخضراء في وقت مبكر من صباح اليوم (أو في دورة الخفيفة من الغرفة النمو في وقت مبكر) وذلك لتجنب تراكم النشا داخل البلاستيدات الخضراء نظرا لعملية التمثيل الضوئي، التي يمكن أن تعيق عزل عضيات سليمة. الإجراء بلاستيدات الخضراء العزلة الذي ينبغي القيام به بسرعة دون أي تأخير لا لزوم لها، ويجب أن تبقى في البلاستيدات الخضراء المعزولة دائما الباردة. هذا هو التخفيف من ملاحظة أن عزل البلاستيدات الخضراء سوف تفقد تدريجيا قدرتها على الاستمرار، وهي ليست جيدة. في حالة استخدام CIB إذابة حديثا أو عازلة HMS، تأكد من خلط عازلة جيدا قبل الاستعمال للحصول على حل متجانسة. وقد وضعت الظروف المثلى لتجانس المواد النباتية تجريبيا، ويمكن أن تختلف إذا تم استخدام الخالط الأنسجة المختلفة.
إذا كانت الأنماط الوراثية النباتية المختلفة تحتوي متشابهةمستويات الكلوروفيل ص، الكلوروفيل الكمي يمكن استخدام وسيلة بديلة لتطبيع عينات قبل إجراء فحوصات الاستيراد. يمكن تحديد الكلوروفيل طيفيا التالية استخراج عينة من البلاستيدات الخضراء المعزولة في 80٪ (ت / ت) الأسيتون مائي 19،20. ومع ذلك، إذا معدلات استيراد النباتات تظهر محتويات الكلوروفيل مختلفة (على سبيل المثال، المسوخ مع الظواهر داء الاخضرار) وينبغي مقارنة، استخدام عدد بلاستيدات الخضراء عد إلى تطبيع عينات بلاستيدات الخضراء في المقايسات الاستيراد. ومن الأهمية بمكان resuspend والبلاستيدات الخضراء تماما في خطوة 3.11. إعادة تعليق غير كاف قد ترك مجاميع من البلاستيدات الخضراء، الأمر الذي سيجعل من الصعب إحصاء عدد بدقة، وبالتالي سوف تعيق التحميل الصحيح في ردود الفعل الاستيراد. إذا كان ينظر تجميع شديد تحت المجهر (على سبيل المثال، يجمع مع> 10 بلاستيدات الخضراء انضمت معا)، لا تزال تهز عينة بلاستيدات الخضراء على الجليد حتى aggregatتتم إزالة العناوين. فمن السهل أن resuspend والبلاستيدات الخضراء في حجم أصغر من العازلة.
من المهم أن ندرك أن ردود الفعل البروتين استيراد (القسم 5) يجب أن تتم مع الاحتياطات المناسبة لطبيعتها المشعة. وتشمل الاحتياطات اللازمة: ارتداء القفازات القابل للتصرف، الملابس المخبرية والنظارات الواقية والرصد وتطهير سطح العمل والمعدات، والتخلص من جميع النفايات المشعة في حاوية النفايات المعتمدة. كما نضع في اعتبارنا أن الضغط الاسموزي الصحيح أمر بالغ الأهمية للحفاظ على intactness من البلاستيدات الخضراء خلال ردود الفعل الاستيراد، وهذا يتم الاحتفاظ بصورة رئيسية من قبل المخزن المؤقت HMS. لأن 10X HMS هي لزجة، فإنه ينبغي أولا أن تكون درجة حرارة تصل إلى RT، ثم يخلط جيدا، وتطبيقها باستخدام قطع ماصة لضمان قياس كميات دقيقة. في رد فعل على الواردات، إضافة الميثيونين البارد لتحول دون إدماج ميثيونين رديولبلد مجانا إلى chloropl لا علاقة لهاالبروتينات AST عن طريق الترجمة organellar خلال الخطوة الحضانة، في حين يتم استخدام جيش صرب البوسنة للحد من التحلل البروتيني من خلال العمل باعتبارها الركيزة لالبروتياز.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة لPJ من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC، منح المرجع BB / K018442 / 1).
Materials
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
Referencias
- Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
- Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
- Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
- Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
- Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
- Flores-Pérez, &. #. 2. 1. 8. ;., Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
- Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
- Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
- Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
- Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, (1989).
- Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
- Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
- Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
- Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
- Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
- Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
- Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).
