Utilizzando il Compound Etilene-releasing, acido 2-Chloroethylphosphonic, come strumento per studiare risposta di etilene in batteri
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
L'etilene olefina (C 2 H 4) fu scoperto come ormone vegetale nel 1901, quando si è osservato che piantine pisello, coltivate in un laboratorio che utilizza lampade a gas di carbone, mostravano una morfologia anomala in cui steli (ipocotili) erano più corte, più spessa e piegato di lato rispetto ai normali piantine di piselli; un fenotipo in seguito definito il 1,2 risposta tripla. Studi successivi hanno dimostrato che l'etilene è un fitormoni vitale che regola numerosi processi di sviluppo come la crescita, la risposta allo stress, la maturazione dei frutti e senescenza 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modello per la ricerca biologia vegetale, è stato ben studiato per quanto riguarda la sua risposta alla etilene. Mutanti risposta Diversi etilene sono stati isolati sfruttando il fenotipo risposta tripla osservato in dark-grown A. piantine thaliana in presenza di etilene 1,4,5. Il precursore biosintetico per la produzione di etilene in piante è 1-aAcido minocyclopropane carbossilico (ACC) 6 ed è comunemente usato per il test di risposta tripla per aumentare la produzione di etilene endogeno che porta alla tripla 1,4,5 risposta fenotipo.
Sebbene la risposta etilene viene ampiamente studiato nelle piante, l'effetto dell'etilene esogeno sui batteri è notevolmente poco studiata nonostante la stretta associazione di batteri con piante. Uno studio ha riportato che alcuni ceppi di Pseudomonas possono sopravvivere con etilene come unica fonte di carbonio e di energia 7. Tuttavia, solo due studi hanno dimostrato che i batteri rispondono all'etilene. Il primo studio ha mostrato che ceppi di Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae erano chemiotattica verso etilene utilizzando un test spina agarosio in cui agarosio fuso è stato mescolato con un buffer chemiotassi equilibrata con gas puro etilene 8. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono stati Furthrapporti er usano gas etilene puro per caratterizzare la risposta di etilene batterica, probabilmente a causa della difficilmente di gestire gas in laboratorio, senza attrezzature specializzate. La seconda relazione di risposta etilene batterica dimostrato che un aumento della produzione di etilene di cellulosa batterica e l'espressione genica influenzato nel batterio frutta-associata, Komagataeibacter (ex Gluconacetobacter) xylinus 9. In questo caso, il composto di etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic (CEPA) è stato usato per la produzione di etilene in situ nel mezzo di crescita batterica, bypassando la necessità di etilene puro o attrezzature specializzate.
CEPA produce etilene in un rapporto 1: 1 molare sopra pH 3,5 10,11 attraverso un primo ordine di reazione base-catalizzata 12 – 14. La degradazione del CEPA è correlata positivamente con pH e temperatura 13,14 e risultati nella produzione di etilene, cloruro e fosfato. CEPA fornisce ai ricercatori interessati a studiare le risposte batterici di etilene con una comoda alternativa per l'etilene gassoso.
L'obiettivo generale dei seguenti protocolli è di fornire un metodo semplice ed efficace per studiare la risposta di etilene batterica e comprende la convalida dei livelli fisiologicamente rilevanti di produzione di etilene da CEPA decomposizione in mezzo di crescita batterica, analisi di pH cultura per assicurare CEPA decomposizione non è compromessa durante crescita batterica, e la valutazione degli effetti dell'etilene sulla morfologia batterica e fenotipo. Dimostriamo questi protocolli che utilizzano K. xylinus, tuttavia, questi protocolli può essere adattato per studiare la risposta di etilene in altri batteri utilizzando il terreno di coltura appropriato e analisi fenotipo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui descritti illustrano la produzione in situ di etilene da CEPA per lo studio della risposta etilene batterica usando l'organismo modello, K. xylinus. Questo metodo è molto utile come etilene può essere prodotto da integrare qualsiasi mezzo acquoso che ha un pH superiore a 3,5 10,11 con CEPA eliminando la necessità di etilene puro o di laboratorio specializzato. Questo metodo non è limitato a studiare gli effetti di etilene CEPA derivato sui batteri, ma può essere anche e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
Referencias
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