Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Como parte do sistema natural killer imune inata (NK) contribuir para a primeira linha de defesa contra as células infectadas com vírus ou transformadas de forma maligna. Um sistema de receptores inibidores e activadores lhes permite distinguir entre células transformadas e saudáveis ​​sem escorva antigénio antes em contraste com as células T. No momento do encontro célula alvo células NK liberar o conteúdo de seus grânulos citotóxicos (por exemplo, perforina, Granzimas) na sinapse imunológico para matar seu alvo. Além disso, as células NK produzem e segregam diferentes tipos de citocinas (por exemplo, interferão-y: IFN-γ; Factor de Necrose Tumoral-α: TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, proteína inflamatória de macrófagos-1β: MIP-1b) sobre células alvo interacção citocina ou ^uma estimulação.

Suficientes funções das células NK, tais como citotoxicidade, quimiocinas e produção de citocinas têm um impacto importante sobre o destino de diversas disfacilita. Pacientes com leucemia mostram taxas de recaída aumenta se eles apresentam um perfil de célula NK com defeito no momento do diagnóstico consiste em produção de IFN-γ reduzida e redução da expressão de ativação de receptores ² células NK. Uma recuperação rápida do número de células NK e do funcionamento, incluindo a produção de citoquinas após interacção célula alvo está associada com uma recaída reduzida e uma melhor taxa de sobrevivência em doentes que receberam transplante de células estaminais alogénicas ^3. Além disso, no início da terapêutica interferon em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C a capacidade desgranulação das células NK periféricas é mais forte nos primeiros respondedores do que em não-respondedores ^4. O número de células NK (> 80 / l) no dia 15 após o transplante de células-tronco autólogas (autoSCT) em pacientes que sofrem de linfoma ou mieloma múltiplo são preditivos de uma melhor progressão livre e de sobrevida global ^5. Em pacientes com melanoma, a expressão de a-célula T immunoglobulin- e mucina-domínio-contendg molécula-3 (TIM-3), uma proteína imuno-reguladora das células NK, correlaciona-se com a fase da doença e o prognóstico ^6.

Os cientistas têm monitorado as funções das células NK ao longo das últimas décadas. A análise inicial da citotoxicidade das células NK contra células tumorais sem escorva antes foi abordada utilizando um ensaio de libertação ^{de 51Cr-7.} Mais recentemente, os cientistas desenvolveram um método não-radioactivos para avaliar a citotoxicidade das células NK expandidos ^8. Citocina e quimiocina produção tem sido frequentemente avaliado utilizando um ensaio de imunossorvente ligado técnicas a enzima (ELISA) ^9,10. Durante as últimas décadas, estes métodos têm sido completada pelo fluxo de ensaios baseados em citometria. A utilização de inibidores de proteína de transporte (por exemplo, brefeldina A e monensina) e métodos de permeabilização celular em combinação com protocolos de coloração de superfície convencionais, permitiram aos cientistas estudar quimiocina e a produção de citocinas em diferentes linfa específicasubconjuntos ocyte (por exemplo, T, B ou células NK) ^11. Além disso, ensaios baseados em citometria de fluxo diferentes têm sido desenvolvidos para monitorizar a citotoxicidade das células T e NK. Em 2004 Alter et ai. Descreveu a expressão de superfície da proteína associada ao lisossoma CD107a (LAMP1) em células NK mediante encontro de células alvo como um marcador para a desgranulação dos grânulos citotóxicos ^12. Uma vez que uma ampla gama de diferentes fluorocromos e citómetros de fluxo multi-canal estão disponíveis nos nossos dias, tornou-se possível monitorizar simultaneamente diversas funções das células NK (citotoxicidade, produção de citoquinas e de quimioquinas) em diferentes subpopulações de células NK. Isto torna-se especialmente importante em situações em que o tamanho da amostra é limitado, por exemplo, em biopsias ou amostras de sangue de pacientes que sofrem de leucopenia.

Para testar as funções das células NK globais, os ensaios baseados em citometria de fluxo diferente pode ser eficientemente combinada. Theorell et al. Células NK estimuladas de headoadores imunda com a linha de células tumorais K562 e analisados a desgranulação das células, o sinal de dentro para fora e de quimiocina produção NK através de citometria de fluxo ^13. Recentemente subgrupos de células NK, fenótipos e funções em pacientes com tumor durante autoSCT foram analisados ​​por meio de fluxo ensaios baseados em citometria. Demonstrou-se que as células NK foram capazes de produzir desgranulam e citocinas / quimiocinas sobre o reconhecimento de células de tumor em tempos precoces depois autoSCT ^11.

Aqui é descrito um protocolo para avaliar as funções das células NK após interacção com células tumorais, incluindo a capacidade de desgranulação, produção de quimioquina e citoquina utilizando um fluxo de ensaio à base de citometria que faz com que seja possível controlar as funções das células NK em subconjuntos diferentes simultaneamente.