Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Den blod-hjärnbarriären separerar den systemiska cirkulationen från det centrala nervsystemet (CNS) 1 – 3. Det ger en fysisk barriär som hämmar den fria rörligheten av celler och spridning av vattenlösliga molekyler och skyddar hjärnan från patogener och potentiellt skadliga ämnen. Förutom dess barriärfunktion, den BBB möjliggör leverans av syre och näringsämnen till hjärnparenkymet, som säkerställer en väl fungerande neuronal vävnad. Funktionella egenskaper hos BBB är starkt reglerad av dess cellulära och acellulära komponenter, med högspecialiserad EC är dess huvudsakliga konstruktionselement. EC av BBB kännetecknas av närvaron av tight junction (TJ) komplex, bristen på fenestrationer, extremt låg pinocytic aktivitet, och permanent aktiva transportmekanismer. Andra komponenter i BBB EG basalmembranet, pericyter inbäddning endotelet, astrocytiska slut fötter och = tillhörande parenchymal basalmembranet också bidra till utveckling, underhåll och funktion BBB 2,4 – 6 och, tillsammans med neuroner och mikroglia, utgör neurovaskulära enheten (NVU), som gör det möjligt för en väl fungerande CNS 7-9.
I en mängd olika neurologiska sjukdomar, såsom neurodegenerativa, inflammatoriska eller infektionssjukdomar, är funktionen hos BBB äventyras 2,5,10b. Dysreglering av TJ-komplex och molekylära transportmekanismer leder till ökad BBB permeabilitet, leukocyter extravasering, inflammation och nervskada. För att studera BBB: egenskaper under sådana patofysiologiska tillstånd, har olika in vitro BBB: modeller etablerats 9,11,12. Tillsammans har de gett värdefulla insikter i de förändringar av barriär integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Dessa modeller använder endotelceller från människa, mus, råtta, gris eller bfår ursprung 13-18; primära endotelceller eller cellinjer odlas antingen som en monokultur eller tillsammans med pericyter och / eller astrocyter, för att efterlikna mer noggrant BBB in vivo 19-25. Under de senaste åren, har mätning av transendotelial elektrisk resistans (TEER) blivit en allmänt accepterad verktyg för att bedöma endotelial barriäregenskaper 26,27.
TEER speglar impedansen till jonflödet över cellmonoskiktet och dess minskning ger en känsligt mått på nedsatt endotelial barriär integritet och därmed ökad permeabilitet. Olika Teer mätsystem har utvecklats, bland annat Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), och realtidscellanalys 15,28 – 30. TEER avspeglar motståndet mot jonflöde mellan angränsande ECS (paracellulär väg) och är direkt proportionell mot denbarriärintegritet. I impedansspektroskopi 27,31, är komplex totala impedansen (Z) mäts, vilket ger ytterligare information om barriär integritet genom att mäta Ccl. Ccl avser den kapacitiva strömmen genom cellmembranet (transcellulär väg): cellskiktet fungerar som en kondensator i den ekvivalenta elektriska kretsen, separation av laddningar på båda sidor av membranet och är omvänt proportionell mot barriärintegritet. När odlas på permeabla skär, EC följa, föröka sig och spridas över det mikroporösa membranet. Detta motstår bakgrunden kapacitiv ström av insatsen (som i sig fungerar som en kondensator) och leder till en minskning i kapacitansen tills den når sin minimala nivå. Detta följs av inrättandet av TJ komplex som tätar av utrymmet mellan intilliggande EC. Detta begränsar jonflödet genom paracellulära vägen, och TEER ökar tills den når sin platå. Under inflammatoriska tillstånd emellertid den endothelial barriären äventyras: TEER minskar då TJ komplexen få störs och Ccl ökar när den kapacitiva komponenten av insatsen ökar igen.
Vår TEER mätning använder automatiserade cell övervakning 32-systemet: det följer principen om impedansspektroskopi och sträcker sina tidigare ansökningar. Här beskriver vi en in vitro-BBB modell som gör studiet av barriäregenskaperna, inklusive interaktion av hjärn endotel med immunceller; i synnerhet aktiverade T-celler. Sådana patofysiologiska tillstånd observeras i autoimmuna sjukdomar i CNS, såsom multipel skleros och dess djurmodell experimentell autoimmun encefalomyelit 33-37. Här är ett avgörande steg i trans av encefalitogena, myelinspecifika T-celler över BBB. Detta följs av deras reaktivering i perivaskulära utrymmet och inträde i hjärnparenkymet, där de rekryterar andra immunceller och migdiate inflammation och efterföljande demyelinisering 1,35,38. Emellertid molekylära mekanismer av interaktionen mellan sådana T-celler och endotelceller, de huvudsakliga beståndsdelarna i BBB, är inte väl förstådd. Vår protokoll syftar till att fylla denna lucka och ge nya insikter i konsekvenserna för endotelceller (dvs barriär integritet och permeabilitet) vid sin direktkontakt och komplext samspel med aktiverade T-celler.
Protokollet som beskrivs här utnyttjar primär mushjärna mikrovaskulära endotelceller, som odlats som ett monolager på släppliga insatser med mikroporösa membran. Endotelceller samodlas med CD4 + T-celler, vilket kan vara pre-aktiverade antingen polyklonalt eller på ett antigenspecifikt sätt. Co-kultur av MBMECs med föraktiverade, men inte naiva T-celler inducerar en minskning av TEER och en ökning av Ccl, som ger ett kvantitativt mått på MBMEC dysfunktion och barriärstörningen. teknikenär icke-invasiv: det använder inbyggd i stället för chopstick elektroder, som förhindrar större störning i EG monoskiktet; den kan användas för att övervaka barriärfunktion utan användning av cellmarkörer. Det gör kontinuerliga mätningar i ett automatiserat sätt och möjliggör en oberoende bedömning av de två spärrparametrar (Teer och CCL) samtidigt över tiden. Metoden är också tillräckligt känsliga för att skilja mellan olika nivåer av T-cellsaktivering och effekterna av sådana T-celler på EC.
Den kan användas i ett brett spektrum av funktionella analyser: olika cytokiner och / eller kemokiner är inblandade i inflammatoriska processer kan läggas till co-kultur MBMECs och T-celler; blockerande antikroppar mot celladhesionsmolekyler på antingen EG eller T-cell-sidan kan användas; och hämmare av T-cellsaktivering markörer eller deras cytolytiska egenskaper kan tillsättas under T-cells priming eller deras co-kultur med EC. Analysen är också användbar för T-celltransmigrationanalyser, eftersom det kan fungera som en kvalitetskontroll av MBMEC monoskikt integritet före tillsatsen av T-celler. Allt detta gör denna metod ett mångsidigt och tillförlitligt verktyg för att studera BBB in vitro, med fokus på effekten av aktiverade T-celler på EG monoskikt integritet. Detta är särskilt viktigt för att förstå mekanismerna i BBB störningar i patogenesen av autoimmuna sjukdomar, såsom MS och dess djurmodell EAE, där självreaktiva, encefalitogena T-celler över BBB och orsaka inflammation och nervskada.
Flera steg av den beskrivna protokollet är väsentliga för ett lyckat experiment. Under den initiala MBMEC isolering och odling, är det avgörande att arbetet utförs under sterila förhållanden så mycket som möjligt, för att förhindra kontaminering av cellkulturen med svampsporer eller bakterier. För att erhålla en ren kultur av EC, är det rekommenderat att använda ett medium innehållande Puromycin för de första tre dagarna, vilket möjliggör överlevnad EC, men inte andra celltyper (särskilt pericyter…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Annika Engbers och Frank Kurth för deras utmärkta teknisk support och Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) för hjälp diskussioner om Teer mätningar. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 till HW och LK, CRC TR128, projekt A08; Z1 och B01 till LK och HW, och tvärvetenskapligt center för klinisk forskning (medicinska fakulteten i Münster) licensnummer KL2 / 2015/14 till LK.
cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |