Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
3 – रक्त मस्तिष्क बाधा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 से प्रणालीगत संचलन अलग करती है। यह एक शारीरिक बाधा है कि कोशिकाओं की मुक्त आवाजाही और पानी में घुलनशील अणुओं के प्रसार को रोकता है और रोगज़नक़ों और हानिकारक पदार्थों से मस्तिष्क की सुरक्षा प्रदान करता है। इसकी बाधा समारोह के अलावा, बीबीबी मस्तिष्क पैरेन्काइमा, जो न्यूरोनल ऊतक के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के लिए सक्षम बनाता है। बीबीबी के कार्यात्मक संपत्तियों अत्यधिक अति विशिष्ट ईसीएस इसकी मुख्य संरचनात्मक तत्व होने के साथ सबसे सेलुलर और अकोशिकीय घटकों द्वारा विनियमित रहे हैं। बीबीबी की ईसीएस तंग जंक्शन (टीजे) परिसरों, fenestrations की कमी, बहुत कम pinocytic गतिविधि है, और स्थायी रूप से सक्रिय परिवहन तंत्र की उपस्थिति की विशेषता है। बीबीबी के अन्य घटकों के चुनाव आयोग के तहखाने झिल्ली, pericytes endothelium, astrocytic अंत पैर और = जुड़े बराबर embeddingन्यूरॉन्स और microglia के साथ एक साथ 6 और, neurovascular इकाई (NVU), जिसमें से सीएनएस 7 समुचित कार्य के लिए सक्षम बनाता है के रूप में – – enchymal तहखाने झिल्ली भी की बीबीबी 2,4 विकास, रखरखाव और समारोह में योगदान 9।
ऐसे neurodegenerative, सूजन या संक्रामक रोगों के रूप में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों की एक किस्म में, बीबीबी के समारोह 2,5,10 समझौता किया है। टी जे परिसरों और आणविक परिवहन तंत्र का अनियंत्रण बीबीबी पारगम्यता, ल्युकोसैट परिस्त्राव, सूजन और neuronal नुकसान वृद्धि की ओर जाता है। ऐसे pathophysiological शर्तों के तहत बीबीबी गुणों का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल 9,11,12 स्थापित किया गया है। साथ में वे बाधा अखंडता, पारगम्यता के साथ ही परिवहन तंत्र के परिवर्तन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इन मॉडलों को मानव, माउस, चूहे, सुअर या बी के endothelial कोशिकाओं को रोजगारovine उत्पत्ति 13 – 18; 25 – प्राथमिक endothelial कोशिकाओं या सेल लाइनों या तो एक मोनोकल्चर के रूप में या pericytes और / या आदेश विवो 19 में और अधिक बारीकी से बीबीबी की नकल करने में astrocytes के साथ एक साथ सुसंस्कृत हैं। हाल के वर्षों में, transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) की माप endothelial बाधा गुण 26,27 आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते उपकरण बन गया है।
तीर सेल monolayer भर आयन प्रवाह को प्रतिबाधा को दर्शाता है और इसकी कमी से समझौता endothelial बाधा अखंडता और इसलिए वृद्धि की पारगम्यता के एक संवेदनशील उपाय प्रदान करता है। 30 – विभिन्न Teer माप सिस्टम उपकला Voltohmmeter (EVOM), इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट मुक़ाबला सेंसिंग (ECIS), और वास्तविक समय सेल विश्लेषण 15,28 सहित विकसित किया गया है। तीर (paracellular मार्ग) आसन्न ईसीएस के बीच आयन प्रवाह के लिए प्रतिरोध को दर्शाता है और सीधे करने के लिए आनुपातिक हैबाधा अखंडता। प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी 27,31 में, जटिल कुल प्रतिबाधा (जेड) में मापा जाता है, जो सीसीएल को मापने के द्वारा बाधा अखंडता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। सीसीएल कोशिका झिल्ली (transcellular मार्ग) के माध्यम से कैपेसिटिव वर्तमान से संबंधित है: सेल परत, बराबर बिजली के सर्किट में एक संधारित्र की तरह कार्य करता झिल्ली के दोनों किनारों पर आरोपों को अलग करने और व्युत्क्रमानुपाती बाधा अखंडता के लिए आनुपातिक है। जब पारगम्य सम्मिलित करता है पर हो, ईसीएस, पालन पैदा करना और microporous झिल्ली में फैल गया। इस डालने की पृष्ठभूमि कैपेसिटिव वर्तमान (जो अपने आप में एक संधारित्र की तरह काम करता है) और समाई में कमी की ओर जाता है, जब तक यह अपने न्यूनतम स्तर तक पहुँच को तैयार नहीं। यह टी जे की स्थापना के द्वारा पीछा किया जाता है आसन्न ईसीएस के बीच अंतरिक्ष के लिए रवाना कि मुहर परिसरों। इस paracellular मार्ग के माध्यम से आयन प्रवाह प्रतिबंधित, और तीर बढ़ जाती है जब तक वह अपने पठार तक पहुँचता है। भड़काऊ शर्तों के तहत, हालांकि, endotheliअल बाधा समझौता किया है: Teer कम हो जाती है टी जे परिसरों बाधित हो और सीसीएल बढ़ जाती है के रूप में डालने की कैपेसिटिव घटक फिर से बढ़ जाता है।
हमारे Teer माप का उपयोग करता है स्वचालित सेल निगरानी प्रणाली 32: यह प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के सिद्धांत को मानता है और अपने पिछले अनुप्रयोगों फैली हुई है। यहाँ, हम इन विट्रो बीबीबी मॉडल है कि बाधा गुण का अध्ययन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क endothelium की बातचीत सहित सक्षम बनाता का वर्णन; विशेष रूप से सक्रिय टी कोशिकाओं में। 37 – इस तरह के pathophysiological की स्थिति ऐसी एकाधिक काठिन्य और उसके पशु मॉडल प्रयोगात्मक autoimmune encephalomyelitis 33 के रूप में सीएनएस के स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों, में मनाया जाता है। इधर, एक महत्वपूर्ण कदम बीबीबी भर encephalitogenic, माइलिन विशेष टी कोशिकाओं की स्थानांतरगमन है। इस परिवाहकीय अंतरिक्ष और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रवेश में उनकी पुनर्सक्रियन द्वारा पीछा किया जाता है, वे अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और मुझे जहाँdiate सूजन और बाद में माइलिन रहित 1,35,38। हालांकि, इस तरह के टी कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत के आणविक तंत्र, BBB के मुख्य घटकों, अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं। हमारी प्रोटोकॉल इस अंतर को भरने और endothelial कोशिकाओं (यानी, बाधा अखंडता और पारगम्यता) उनके सीधे संपर्क और जटिल परस्पर क्रिया पर सक्रिय टी कोशिकाओं के साथ पर परिणामों में नए अंतर्दृष्टि देने के लिए करना है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं, microporous झिल्ली के साथ पारगम्य सम्मिलित करता है पर एक monolayer के रूप में उगाया का उपयोग करता है। Endothelial कोशिकाओं सह सुसंस्कृत सीडी 4+ टी कोशिकाओं है, जो या तो polyclonally या एक विशिष्ट प्रतिजन फैशन में पूर्व सक्रिय हो सकते हैं के साथ कर रहे हैं। पूर्व सक्रिय है, लेकिन नहीं भोले टी कोशिकाओं के साथ MBMECs के सह-संस्कृति Teer में कमी और सीसीएल में वृद्धि हुई है, जो MBMEC शिथिलता और बाधा व्यवधान का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है लाती है। तकनीकगैर इनवेसिव है: यह chopstick इलेक्ट्रोड, जो चुनाव आयोग monolayer के प्रमुख गड़बड़ी रोकने के बजाय निर्मित में उपयोग करता है; यह सेल मार्कर के उपयोग के बिना बाधा समारोह पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक स्वचालित फैशन में सतत मापन करता है और दो बाधा मानकों (तीर और सीसीएल) एक साथ समय के साथ की एक स्वतंत्र मूल्यांकन सक्षम बनाता है। विधि को भी काफी संवेदनशील टी सेल सक्रियण के विभिन्न स्तरों और ईसी पर इस तरह के टी कोशिकाओं के प्रभाव के बीच भेद करने के लिए है।
यह कार्यात्मक assays की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग किया जा सकता है: अलग साइटोकिन्स और / या chemokines सूजन प्रक्रियाओं में फंसा MBMECs और टी कोशिकाओं के सह संस्कृति को जोड़ा जा सकता है; पर या तो चुनाव आयोग या टी सेल की ओर सेल आसंजन अणुओं के खिलाफ अवरुद्ध एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है; और टी सेल सक्रियण मार्कर की या उनके cytolytic संपत्तियों की अवरोधकों टी सेल भड़काना या ईसीएस के साथ उनके सह-संस्कृति के दौरान जोड़ा जा सकता है। परख भी टी सेल स्थानांतरगमन के लिए उपयोगी हैassays, के रूप में यह MBMEC monolayer अखंडता टी कोशिकाओं के अलावा पहले की एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं। यह सब इस विधि चुनाव आयोग monolayer अखंडता पर सक्रिय टी कोशिकाओं के प्रभाव पर ध्यान देने के साथ, इन विट्रो में बीबीबी अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी और विश्वसनीय उपकरण बनाती है। यह ऐसे एमएस और उसके पशु मॉडल EAE, जहां आत्म प्रतिक्रियाशील, encephalitogenic टी कोशिकाओं बीबीबी पार और सूजन और neuronal नुकसान का कारण के रूप में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के रोगजनन में बीबीबी विघटन के तंत्र को समझने के लिए विशेष महत्व का है।
वर्णित प्रोटोकॉल के कई कदम एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक हैं। प्रारंभिक MBMEC अलगाव और संस्कृति के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि काम कवक spores या बैक्टीरिया के साथ सेल संस्कृति के प्रदूषण को रोकने के लिए, जितना सं?…
The authors have nothing to disclose.
हम Teer माप के बारे में उपयोगी विचार विमर्श के लिए Annika Engbers और उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए फ्रैंक कुर्थ और डॉ मार्कस Schäfer (nanoAnalytics GmbH) के आभारी हैं। यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था, HW और लालकृष्ण, सीआरसी TR128, को SFB1009 परियोजना A03 A08 परियोजनाओं; Z1 और B01 लालकृष्ण और HW, और क्लीनिकल रिसर्च के लिए अंतःविषय केंद्र (हैम्बर्ग के मेडिकल संकाय) अनुदान संख्या Kl2 / 2015/14 लालकृष्ण करने के लिए।
cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |