Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Blod-hjerne-barrieren adskiller det systemiske kredsløb fra centralnervesystemet (CNS) 1 – 3 ud. Det giver en fysisk barriere, der hæmmer den frie bevægelighed for celler og udbredelsen af vandopløselige molekyler og beskytter hjernen mod patogener og potentielt skadelige stoffer. Ud over sin barrierefunktion, BBB muliggør levering af ilt og næringsstoffer til hjernen parenkym, der sikrer et velfungerende neuronalt væv. Funktionelle egenskaber af BBB er stærkt reguleret af dens cellulære og acellulære komponenter, med højt specialiseret EC'er er dens vigtigste strukturelement. EC'er af BBB er karakteriseret ved tilstedeværelsen af tight junctions (TJ) komplekser, manglen på fenestrationer, ekstremt lav pinocytic aktivitet, og permanent aktive transportmekanismer. Andre dele af BBB EF basalmembran, pericytter indlejring endotelet, astrocytiske ende fødder og = associeret parienchymal basalmembran også bidrage til udvikling, vedligeholdelse og funktion af BBB 2,4 – 6 og sammen med neuroner og mikroglia, danner neurovaskulære enhed (NVU), som gør det muligt velfungerende CNS 7-9.
I en række neurologiske sygdomme, såsom neurodegenerative, inflammatoriske eller infektiøse sygdomme, er funktionen af BBB kompromitteret 2,5,10. Dysregulering af TJ komplekser og molekylære mekanismer transport fører til øget BBB-permeabilitet, leukocyt-ekstravasation, inflammation og neuronbeskadigelse. For at studere BBB egenskaber under sådanne patofysiologiske tilstande, har forskellige in vitro BBB-modeller fastslået 9,11,12. Sammen har de givet værdifuld indsigt i ændringerne i barriere integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Disse modeller anvender endotelceller fra mennesker, mus, rotte, svin eller b forfår oprindelse 13-18; primære endotelceller eller cellelinier dyrkes enten som en monokultur eller sammen med pericyter og / eller astrocytter for at efterligne nærmere BBB in vivo 19 – 25 år. I de senere år har måling af transendotelmigrering elektrisk modstand (TEER) blevet en bredt accepteret redskab til at vurdere endotel barriereegenskaber 26,27.
TEER afspejler impedans til ion flux hen cellemonolaget, og dens fald tilvejebringer et følsomt mål for kompromitteret endothelial barriere integritet og dermed øget permeabilitet. Forskellige TEER målesystemer er blevet udviklet, herunder Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), og real-time-celle analyse 15,28 – 30. TEER afspejler modstanden mod ionstrøm mellem hosliggende EC'er (paracellulær vej) og er direkte proportional medbarriereintegritet. I impedans spektroskopi 27,31, er kompleks samlede impedans (Z) målt, som giver yderligere oplysninger om barriere integritet ved at måle Ccl. CCL angår den kapacitive strøm gennem cellemembranen (transcellulær vej): cellelaget fungerer som en kondensator i den ækvivalente elektriske kredsløb, adskillelse af afgifter på begge sider af membranen og er omvendt proportional med barriere integritet. Når dyrket på permeable indsatser, EC'er klæbe, formere sig og spredes over mikroporøs membran. Dette modstår baggrunden kapacitive strøm af indsatsen (som i sig selv virker som en kondensator), og fører til et fald i kapacitansen, indtil den når sin minimale niveau. Dette efterfølges af etableringen af TJ komplekser, segl fra rummet mellem tilstødende EC'er. Dette begrænser ionstrøm gennem den paracellulære rute, og TEER øges indtil den når sin plateau. Under inflammatoriske tilstande imidlertid endothelial barriere er kompromitteret: TEER falder som TJ komplekser bliver forstyrret og Ccl stiger som den kapacitive komponent af indsatsen stiger igen.
Vores TEER måling bruger den automatiske overvågning celle 32-system: Det følger af princippet om impedans spektroskopi og udvider sine tidligere ansøgninger. Her beskriver vi en in vitro BBB model, der muliggør studiet af barriereegenskaberne, herunder interaktionen af hjernen endotel med immunceller; især aktiverede T-celler. Observeres sådanne patofysiologiske tilstande i autoimmune sygdomme i CNS, såsom multipel sklerose og dens dyremodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis 33 -. 37 Her et afgørende skridt er sjælevandring af encephalitogene, myelin-specifikke T-celler på tværs af BBB. Dette er efterfulgt af deres reaktivering i perivaskulære rum og indtræden i hjerneparenkym, hvor de rekrutterer andre immunceller og migdiat inflammation og efterfølgende demyelinering 1,35,38. Imidlertid molekylære mekanismer for interaktionen mellem sådanne T-celler og endotelceller, de vigtigste bestanddele af BBB, er ikke godt forstået. Vores protokol har til formål at udfylde dette hul og give nye indsigter i konsekvenserne på endotelceller (dvs. barriere integritet og permeabilitet) efter deres direkte kontakt og komplekse samspil med aktiverede T-celler.
Protokollen beskrevet her gør brug af primære musehjerne mikrovaskulære endotelceller dyrket som et monolag på permeable skær med mikroporøse membraner. Endotelceller samdyrkes med CD4 + -T-celler, som kan være præ-aktiverede enten polyklonalt eller et antigen-specifik måde. Co-kultur af MBMECs med præ-aktiverede, men ikke naive T-celler inducerer et fald i TEER og en stigning i Ccl, som tilvejebringer et kvantitativt mål for MBMEC dysfunktion og barrierenedbrydning. teknikkener ikke-invasiv: det bruger indbygget i stedet for spisepind elektroder, som forhindrer større forstyrrelse af EF-monolag; det kan bruges til at overvåge barrierefunktion uden brug af cellemarkører. Det gør kontinuerlige målinger i en automatiseret måde og muliggør en uafhængig vurdering af de to barriere parametre (TEER og CCL) samtidigt over tid. Metoden er også følsom nok til at skelne mellem forskellige niveauer af T-celle aktivering og effekter af sådanne T-celler på EC'er.
Det kan bruges i en lang række funktionelle assays: kan tilsættes forskellige cytokiner og / eller chemokiner impliceret i inflammatoriske processer til co-kultur af MBMECs og T-celler; kan anvendes blokerende antistoffer mod celleadhæsionsmolekyler på enten EF eller T-celle side; og inhibitorer af T-celleaktivering markører eller deres cytolytiske egenskaber kan tilsættes under T-celle-priming eller deres co-kultur med EC'er. Assayet er ligeledes nyttig til T-celle-transmigrationassays, da det kan tjene som en kvalitetskontrol af MBMEC monolag integritet inden tilsætningen af T celler. Alt dette gør denne metode et alsidigt og pålideligt værktøj til at studere BBB in vitro, med fokus på effekten af aktiverede T-celler på EF monolag integritet. Dette er af særlig betydning for at forstå mekanismerne i BBB forstyrrelser i patogenesen af autoimmune sygdomme, såsom MS og dens dyremodel EAE, hvor selvnedbrydende, encephalitogene T-celler krydser BBB og forårsage betændelse og neuronal beskadigelse.
Flere trin af den beskrevne protokol er afgørende for en vellykket eksperiment. Under den indledende MBMEC isolering og dyrkning, er det afgørende, at arbejdet udføres under sterile betingelser så meget som muligt, for at hindre kontaminering af cellekulturen med svampesporer eller bakterier. For at opnå en ren kultur af EC'er, anbefales det at anvende et medium indeholdende puromycin for de første tre dage, hvilket muliggør overlevelse af EC'er, men ikke andre typer celler (især pericytter) 41,42.<…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Annika Engbers og Frank Kurth for deres fremragende teknisk support og Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) til nyttige diskussioner om TEER målinger. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 til HW og LK, CRC TR128, projekter A08; Z1 og B01 til LK og HW, og Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (Medical Faculty of Münster) tilskud nummer KL2 / 2015/14 til LK.
cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |