Экспресс-анализ циркадных фенотипы в Arabidopsis протопластов трансфицируют Люминесцентные Clock Reporter
Summary
Циркадные часы регулирует около трети транскриптома Arabidopsis, но процент генов, которые питаются обратно в хронометраже остается неизвестным. Здесь мы представляем метод быстрой оценки циркадных фенотипы в любой мутантной линии Arabidopsis с использованием люминесцентного визуализации циркадного репортера скоротечно, выраженной в протопласты.
Abstract
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
Introduction
Большинство живых организмов обладают эндогенной хронометристу для помощи эффективного переговорного процесса ежедневных изменений в окружающей среде. Это хронометрист, циркадные часы, регулирует многие аспекты метаболизма и физиологии организма предвидеть предсказуемые изменения во внешней среде. В растениях, например, ожидание во времени предсказуемых патогена или травоядных атак сильно снижает общую восприимчивость 1 – 4. Крахмал метаболизм жестко регулируется циркадных часов, чтобы гарантировать , что запасы крахмала в прошлом до рассвета ли выращивали при длинных или коротких условиях 5 -й день. Действительно, растения с циркадных часов , соответствующих 24 часа в сутки окружающей среды показывают повышенные темпы роста, темпы фиксации углерода и показатели выживаемости по сравнению с растениями , работающих под управлением часы ложноспаренной периода 6. Обширное влияние циркадных ритмов во всех этих процессах возникает в значительной степени от ритмической регуляции до третиот общего транскриптома в Arabidopsis 7. Эти ритмические генные продукты участвуют в широком диапазоне клеточных процессов , включая метаболических путей, сигнализации гормонов, а также реакции на стресс 7. Кроме того, прямое циркадный регуляция функции белка устанавливается циркадный регуляции фосфорилирования 8 и , скорее всего , других посттрансляционных модификаций (PTMs).
В центре циркадных часов , который приводит этот ежедневный транскрипционный перепрограммирование лежит сеть транскрипционных / поступательной петли обратной связи (TTFLs), включая утренние экспрессируется генов циркадных часов , СВЯЗАННЫЕ 1 (CCA1) и позднюю УДЛИНЕННЫЕ гипокотиля (LHY) , которые подавляют экспрессию в вечерние гены СРОКАХ САВ 1 (МТЗ 1), Gigantea (GI) и членов вечернего комплекса (ЕС), LUX ARRHYTHMO (LUX), ранним цветением 3 (ELF3) и ELF4 9 – 11. Вместе остроумиеч Регулятора -genes ПСЕВДО RESPONSE (PRR3, 5, 7 и 9), МТЗ 1 репрессирует экспрессию CCA1 / LHY в то время как ЕС выступает в качестве положительного регулятора 12 – 14. В дополнение к механизмам обратной связи, пост-транскрипционных и пост-трансляционной регулирование TTFL сетевых компонентов играет важную роль в настройке циркадных ритмов. На сегодняшний день наиболее распространенным PTM идентифицированы на циркадные белки часы фосфорилирование 15. Фосфорилирования CCA1 по казеинкиназой 2 (СК2) влияет на его связывание с целевой промоутеров 16 и имеет важное значение для температурной компенсации циркадных часов 17. ПРР белки фосфорилируются дифференцированно по циркадного цикла и фосфорилирования МТЗ 1 влияет на взаимодействие с отрицательным регулятором, вечером-фазированной часы компонент ZEITLUPE (ЗТЛ) 18. Эти примеры иллюстрируют, как PTMs и белок-белковых взаимодействий настраивать сеть TTFL в 24-чтранскрипционный осциллятора. Для более детального введения в транскрипционный сети тактовой частоты и ее регулирования, отличные недавние обзоры доступны (например , ссылка 15).
Тем не менее, то, что остается менее ясно, в какой степени ритмично регулируемые процессы и другие аспекты клеточного метаболизма обратной связи в сам механизм хронометража. Обширный скрининг мутантов Arabidopsis тактовых дефектов может получить дальнейшее понимание того, какие механизмы или сигнальные пути могут быть вовлечены в поколение 24 ч ритмов от сети TTFL. С этой целью, Ким и Сомерс ранее опубликовал метод прорывной для эффективного и быстрого анализа функции часов в любой Arabidopsis строке 19. На основе использования транзиторной экспрессии в протопласты, эта методика превосходит потребность в стабильных трансгенных линий или пересекает с люминесцентными линиями часов маркер. Здесь мы представляем Высокопродуктивное протопластов isolatioп метод 20 в сочетании с оптимизированным протоколом для скрининга циркадные дефектов люминесцентными визуализации скоротечно выраженных маркеров тактового импульса в 96-луночный планшет – ридере.
Мы сравним дикого типа сталкивающихся 0 Arabidopsis хорошо охарактеризованных мутантов часы , чтобы подтвердить методику , описанную здесь успешно обнаруживает измененные циркадные ритмы. Протопласты , полученные из этих линий трансфицированных репортерной конструкцией, выражающего светлячка люциферазы из циркадного CCA1 промотора; CCA1pro: LUC 19. Люциферазы катализирует многоэтапную реакцию , в которой люциферин превращается в электронно – возбужденным оксилюциферин , который излучает свет 21, который визуализируется с течением времени для оценки периода, амплитуды и фазы транскрипционных ритмов в этих протопластов.
Протокол состоит из трех основных частей; изолируя протопластов, трансфекция протопластов с репортерной плазмидой, и люминесцентного имстарения. Эти три части должны быть выполнены в один день, используя свежеприготовленные буферы и реагенты. рост и очистка достаточного количества репортерной плазмиды растений следует проводить заранее и не визуализируются в этом протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем быстрый анализ на экран периода циркадного дефектов в Arabidopsis линиях, в том числе изоляции протопластов, трансфекция и визуализации luminecent. Циркадный период дикого типа Arabidopsis и часы мутанты cca1 / LHY, ЗТЛ и CCA1 -ox рассчитывали из измерений люминесценции из CCA1pro: репортера LUC и обнаружили, что согласуется с литературными данными , полученных из целых растений с использованием более время- потребляющие трансгенные подходы (таблица 2). С помощью этого теста для скрининга мутантов Arabidopsis позволяет избежать первоначального требования для создания трансгенных светящихся линий, что отнимает много времени и, возможно, только показывает, что конкретный мутант проявляет ритмы дикого типа. Явным преимуществом этого протокола является то , что любой Arabidopsis линии могут быть подвергнуты скринингу в короткое время для измененных циркадных ритмов транскрипционных, которые помогут идентифицировать более генов , влияющих на хронометраж в растениях.
<p class= "Jove_content"> Выделение протопластов может быть трудоемким, особенно если мутантный линия отображает карликовых фенотип. Ранее сообщалось , способы получения протопластов включают резки листьев или рассаду на тонкие полоски и вакуума , проникающих полоски с раствором фермента , чтобы ферменты , чтобы достигнуть клеточных стенок 26,27. Последующее переваривание требует, по меньшей мере, 3 ч инкубации в темноте, чтобы выпустить протопластов в раствор фермента. При вакуумной инфильтрации не применяется, инкубационный время до 18 часов рекомендуется. В протоколе, представленном здесь, вакуумная инфильтрация является ненужным, поскольку слой эпидермальных клеток непроницаемы для ферментов, удаляется с помощью ленты. При создании протопластов путем разрезания растительного материала необходимо отделить протопласты от клеточной стенки мусора после пищеварения; Обычно это делается путем фильтрации раствора или его очистки на сахар градиента 27,26. Здесь любой непереваренной ткани останется на ленте после автоклавнойпищеварение, поэтому фильтрация и очистка сахара градиент протопластов может быть опущена. Существует вероятность того, что стресс в результате длительных процедур protoplasting влияет на жизнеспособность клеток и циркадных часов. Ленту на основе метода protoplasting 20 визуализируется здесь дает большое количество протопластов; и учитывая жизнеспособность клеток в течение циркадного временных рядов и согласующие длин периодов протопластов и целых проростков (таблица 2), методология , описанная здесь , является предпочтительным по сравнению с альтернативными методами для генерации протопласта.Стадию трансфекция протокола является важным шагом, который влияет на жизнеспособность протопластов. Раствор ПЭГ позволяет ДНК должны быть доставлены в клетку, и оба времени инкубации в этом растворе (этап 3.4) и процент PEG должен быть определен эмпирически. Стандартная концентрация составляет 20%, при более низких концентрациях, снижающих эффективность трансформации и вышеКонцентрации , снижающие жизнеспособность 28. Инкубационный период короче , как пять минут может дать эффективную трансфекцию протопластов 27.
Протопласты могут быть отображены на любой платформе люминесцентный визуализации. В этом видео мы использовали люминесценция планшет-ридер, оснащенный внешними огнями (красный и синий светодиоды, 630 и 470 нм, соответственно, при комбинированной интенсивности ~ 20 мкЕ), что позволяет для скрининга с высокой пропускной способностью и частых измерений. Другое оборудование формирования изображения, которое обнаруживает люминесценцию, такие как читатели альтернативных пластин или установок, основанных вокруг прибор с зарядовой связью (CCD) камеры, могут быть применены одинаково хорошо до тех пор, как освещение для фотосинтеза. Преимущество использования ПЗС-камеры, установленной на контролируемом шкафу, что свет и температура могут быть запрограммированы. Недостатком является то, тем больше времени захвата, вводя длительные периоды темноты, которые могут вызвать стресс протопластов в дополнение к возмущаютING эндогенный хронометража. Вне зависимости от экспериментальной платформы выбрана, настройка параметров, вероятно, будет необходимо по сравнению с установками для рассады или взрослых растений. По нашему опыту, повышение концентрации репортер плазмиды во время трансфекции и / или люциферин в буфере изображений может разрешить любые неустойчивые или быстро сдерживающее ритмы, которые могут возникнуть в первоначальных экспериментах.
В будущих экспериментов, методология, описанная здесь, может быть применена для изучения циркадных фенотип любого мутанта Arabidopsis линии. С небольшими изменениями, влияние например различных препаратов на хронометража могут быть изучены в этой установке. Кроме того, трансфекция может быть изменен , чтобы включать в себя искусственную микроРНК для гена глушителей 19, дальнейшее расширение универсальности этого протокола. Протоколы для генерации протопласты риса хорошо отлаженных 29 и протокол формирования изображения , представленные здесь в равной степени может быть применен для дальнейшего нашего Understanding тактового сигнала в экономически важных однодольных культурных растений.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
Materials
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
Referencias
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
- Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).
- Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
- Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
- Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).
- Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
- Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
- Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
- Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
- Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
- Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
- Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
- Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
- Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
- Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
- Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
- Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
- Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).
- Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
- Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
- Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
- Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).
