발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석
Summary
주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.
Abstract
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
Introduction
대부분의 생명체는 환경에 대한 매일의 변화를 효율적으로 협상을 돕기 위해 내생 시계를 가지고있다. 이 시계의 일 주기성 시계는 외부 환경에서 예측 가능한 변화를 예측하는 생물의 신진 대사와 생리학의 여러 측면을 조절한다. 4 – 예를 들어 식물에서, 시간적으로 예측 병원균이나 초식 동물의 공격을 예상 강하게 전체 감수성 1을 줄일 수 있습니다. 전분 대사는 긴밀하게 길거나 짧은 하루 조건 5에서 성장 여부를 새벽까지 마지막 전분 매장량을 보장하기 위해 일 주기성 시계에 의해 조절된다. 실제로, 24 시간의 환경 쇼 증가 성장률 일치 주기성 시계 식물, 탄소 고정 률과 생존율 동안 부정합 (6)의 클럭을 실행하는 식물에 비해. 이 모든 과정에서 활동 일주기의 광범위한 영향은 세 번째까지의 리듬 규정에서 크게 발생애기 장대 (7) 총 사체의. 이러한 리듬 유전자 산물이 대사 경로 호르몬 신호 및 스트레스 반응 7 세포 과정을 포함하는 넓은 범위에 포함된다. 그 꼭대기에, 단백질 기능을 직접 주기성 조절이 인산화 8 일주기 규제와 아마 다른 번역 후 변형 (PTMS)에 의해 설정됩니다.
이 매일 전사 재 프로그램을 구동하는 일 주기성 시계의 중심에 / 번역 피드백 아침 발현 유전자를 포함하는 (TTFLs을), 루프 전사의 네트워크 거짓말 발현을 억제 주기성 시계 ASSOCIATED 1 (CCA1) 및 LATE 연장 배축 (LHY) – 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), 개화 3 (ELF3), 및 ELF4 9, 저녁 유전자 CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) 저녁 복합체 (EC)의 구성원의 타이밍의. 함께 지혜H 의사 RESPONSE 레귤레이터 -genes (PRR3, 5, 7, 9) EC가 양의 레귤레이터 (12)로서 작용하는 반면, TOC1가 CCA1 / LHY 발현을 억제한다 – 14. TTFL 네트워크 구성 요소의 피드백 메카니즘에 추가적인 전사 후 및 번역 후 조절은 튜닝 활동 일주기에서 중요한 역할을한다. 현재까지, 일 주기성 시계 단백질에 확인 된 가장 풍부한 PTM은 인산화 (15)이다. 카제인 키나제 2 (CK2)에 의해 CCA1의 인산화는 발기인 16을 대상으로 바인딩과 주기성 시계 (17)의 온도 보상을위한 중요한 영향을 미친다. PRR 단백질이 차등 일주기 사이클에 인산화 및 TOC1의 인산화가 부정적인 레귤레이터와의 상호 작용에 영향을 미치는되어, 저녁 – 위상 클럭 구성 요소 ZEITLUPE (ZTL) 18. 이러한 예는 설명 방법을 24 시간에 PTMS 및 단백질 – 단백질 상호 작용을 조정 TTFL 네트워크전사 발진기. 전사 시계 네트워크 및 규제에 대한보다 자세한 소개는, 우수한 최근 리뷰 (예를 들어 기준 15)을 사용할 수 있습니다.
그러나 무엇 불분명 남아있는 것은 리듬 조절 과정과 세포 대사의 다른 측면은 다시 계시 메커니즘 자체에 공급하는 정도입니다. 시계 결함에 대한 애기 장대 돌연변이의 광범위한 선별 메커니즘 또는 신호 전달 경로가 TTFL 네트워크에서 24 시간 리듬의 생성에 관여 할 수있는 더 이해를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 김 써머 이전에 어떤 애기 라인 (19)에 시계 기능의 효율적이고 신속한 분석을위한 돌파구 방법을 발표했다. 원형질체의 과도 발현의 사용에 기초하여,이 방법은 안정한 형질 전환 라인에 대한 필요성을 능가 또는 형광 마커 클록 라인에 교차. 여기에, 우리는 높은 항복 원형질체의 isolatio을 시각화최적화 프로토콜과 함께 해당 방법 20 96- 웰 플레이트 판독기에서 일시적으로 발현 클록 마커 발광 이미징에 의해 주기성 결함을 선별한다.
우리는 변경된 활동 일주기를 감지 여기에 성공적으로 설명하는 방법을 확인하기 위해 잘 특성화 시계 돌연변이 체에 야생형 Col- 0 애기을 비교합니다. LUC 19 : CCA1pro,이 라인에서 파생 된 원형질체는 주기성 CCA1 발기인에서 반딧불의 루시 페라을 표현 리포터 구조로 형질된다. 루시퍼 라제는 이러한 원형질체의 기간의 진폭 및 전사 리듬의 위상을 평가 시간이 지남에 이미징되는 광 출사 21 oxyluciferin 루시페린이 전자적으로 여기 된 변환 된 다단계 반응을 촉매.
프로토콜은 세 개의 주요 부분으로 구성된다; 리포터 플라스미드 및 발광 IM로 원형질체를 형질 감염, 원형질체를 분리노화. 이들 세 부분은 항상 새로 제조 완충액 및 시약을 사용하여 매일 수행한다. 식물 성장 및 리포터 플라스미드 충분한 양의 정제를 미리 수행되어야하며, 이러한 프로토콜에서 가시화되지 않는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 원형질체 분리, 형질 전환 및 luminecent 영상을 포함한 애기 라인의 circadian 기간 결함을 화면에 신속한 분석을 제시한다. 야생형의 일주기 기간 애기 장대와 시계 돌연변이 cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1 -ox는 CCA1pro에서 발광 측정으로부터 계산 하였다 : LUC 기자와 더 많은 시간 -를 사용하여 전체 식물에서 생성 된 게시 된 데이터와 일치하는 것으로 소비 형질 전환 방법 (표 2). 애기 돌연변이를 스크리닝이 분석을 사용하여 시간이 걸리고 전용 특정 돌연변이는 야생형 리듬을 나타내는 것으로 밝혀 수도 형질 발광 라인을 생성하도록 초기 조건을 회피한다. 이 프로토콜의 명확한 장점은 애기 장대 라인은 식물의 타임 키핑에 영향을 미치는 많은 유전자의 식별 도움이 될 것 변경된 주기성 전사 리듬을 위해 짧은 시간에 상영 될 수 있다는 것이다.
<p class= "jove_content"> 원형질체의 분리가 돌연변이 라인이 위축 표현형을 표시 특히, 힘드는 일 수있다. 원형질체를 생성하기위한 이전에보고 된 방법은 효소 셀벽 (26, 27)에 도달하도록하는 효소 용액으로 스트립 침투 얇은 스트립 진공으로 잎 또는 모종 절단 포함한다. 후속 소화 효소 용액으로 원형질체를 분리하는 어두운 적어도 3 시간 동안 배양을 필요로한다. 진공 침투가 적용되지 않는 경우 18 시간까지 배양 시간의 최대 권장된다. 효소로 꿰 뚫을 표피 세포층이 테이프에 의해 제거되기 때문에 여기에 제시된 프로토콜에서 진공 함침이 불필요하다. 식물 재료를 절단하여 원형질체를 생성 할 때 이것은 소화 후 세포벽 파편 원형질체로부터 분리 할 필요가있다; 이것은 일반적으로 상기 용액을 여과 또는 당 그라데이션 27,26에 정제가 수행된다. 여기에, 모든 소화되지 않은 조직은 오토 클레이브 테이프 이후에 남아소화 원형질체 여과 설탕 구배 정제를 생략 할 수 있도록. 장기간 protoplasting 절차에 기인하는 응력이 세포 생존 및 주기성 시계에 영향을 미치는 가능성이있다. 여기 시각화 테이프 기반 protoplasting 방법 (20)는 원형질체의 높은 숫자를 산출; 및 주기성 시계열상에서 세포의 생존 능력을 부여하고 원형질체 및 전체 모종 (표 2)의 정합 기간의 길이는 여기에 설명 된 방법은 원형질체를 생성하는 다른 방법에 비해 바람직하다.프로토콜의 형질 전환 단계는 원형질체의 생존에 미치는 영향 중요한 단계이다. 페그 용액을 세포 내로 전달하는 DNA, 두 배양 시간이 용액에 (단계 3.4) 및 실험적으로 결정되어야한다 PEG의 비율을 가능하게한다. 표준 농도 변환 효율 및 높은 저감 낮은 농도로 20 % 인생존 (28)을 감소 농도. 오분 같은 짧은 배양 시간은 원형질체 (27)의 효율적인 형질 전환을 수득 할 수있다.
원형질체는 어떤 발광 이미징 플랫폼에서 이미지화 할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 검사 및 자주 측정 할 수 있습니다 (~ 20 μE의 결합 강도에 각각 빨간색과 파란색의 LED, 630 및 470 nm의) 외부 조명이 장착 된 발광 플레이트 리더를 사용하고 있습니다. 조명 광합성 사용할 바와 같은 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 기반 대안 플레이트 리더 나 설정 등의 발광을 검출하고, 다른 촬상 장치는, 긴 똑같이 잘 적용될 수있다. 제어 가능한 캐비닛에 장착 된 CCD 카메라를 사용하는 장점은 가볍고 온도를 프로그래밍 할 수있다. 단점은 교란에 추가하여 원형질체에 스트레스를 일으킬 수 어둠의 장기간을 도입, 긴 캡처 시간내생 계시를 보내고. 에 관계없이 선택 실험하는 플랫폼의 설정을 조정 모종 또는 성숙한 식물에 대한 설정과 비교해야 할 것으로 보인다. 우리의 경험에서 영상 버퍼에 형질 전환 및 / 또는 루시페린 동안 리포터 플라스미드의 농도를 증가시키는 것은 초기 실험에서 발생할 수있는 불규칙하거나 빠르게 둔화 리듬을 해결할 수 있습니다.
미래의 실험에서, 여기에 설명 된 방법은 임의의 돌연변이 애기 라인의 주기성 표현형 연구에 적용될 수있다. 약간의 수정과 함께, 계시에 예를 들어, 다양한 약물의 효과는이 설정에서 연구 할 수있다. 또한, 형질 감염은 또한이 프로토콜의 다양성을 확대 19 유전자 침묵 인공 마이크로 RNA를 포함하도록 수정 될 수있다. 쌀 원형질체를 생성하는 프로토콜 29 잘 확립되어 있으며 여기에 제시된 촬상 프로토콜 동등 우리 U를 더욱 적용될 수있다경제적으로 중요한 단자엽 작물의 시계 nderstanding.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
Materials
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
Referencias
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