Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
Det kännetecknande för humoral immunitet är att generera funktionella DSKer som syntetiserar och utsöndrar Abs specifik för ett antigen (Ag), såsom en patogen, och som används för värdförsvar. För kvantitativ bestämning av den funktionella statusen av det humorala immunsvaret hos en individ, både serum Abs och cirkulerande DSKer vanligen mätt som funktionella avläsningar. Hos människa är perifert blod den mest praktiska och lättillgänglig prov som kan användas för bestämning av det humorala immunsvaret som framkallas av värd B-celler. Distinkta B-cellundergrupper, inklusive DSKer, kan isoleras direkt från perifert blod via selektion med härstamningsspecifika Ab-konjugerade mikropärlor eller via cellsortering med flödescytometri. Dessutom kan renade naiva och minnes-B-celler aktiveras och differentieras till DSK: er i odling. De funktionella aktiviteter DSK att bidra till Ab sekre kan kvantifieras genom ELISpot, vilket är en analys som konvergerar enzym-kopplad immunoabsorbance analys (ELISA) och Western blotting-teknik för att möjliggöra räkning av enskilda ASC: er vid enkelcellnivån. I praktiken har det ELISpot-analysen blivit allt vanligare att utvärdera vaccinets effektivitet på grund av den lätthet vid hantering av ett stort antal blodprov. Metoderna för att isolera humana B-celler från perifert blod, kommer differentieringen av B-celler i DSK: er in vitro och anställning av ELISpot för kvantifiering av totala IgM- och IgG-DSKer beskrivas här.
Introduction
B-celler spelar en central roll i utvecklingen av humoral immunitet. De initialt utvecklas i benmärgen och in i blodomloppet som naiva B-celler, som kan vandra in i lymfvävnader såsom mjälte, lymfkörtlar och tonsiller, för vidareutveckling. Vid Ag möter några naiva B-celler migrerar till lymfoida folliklar, där germinal center B-celler kan differentiera till minnes-B-celler och plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Medan de flesta PBS / PC utträde in i blodomloppet, några så småningom uppehålla sig i benmärgen att genomgå terminal differentiering till långlivade datorer 1. B-celler i omlopp är heterogena, och vid steady state, PBS / datorer är sällsynta i perifert blod 2. Som ett resultat av tillgängligheten av härstamningsspecifika ytmarkörer, har flödescytometri blivit en populär metod för identifiering och karakterisering av de B-cellundergrupper i perifert blod. En utvidgad tillämpning av flödes cytometry är tillägget av en cellsorterare funktion, som medger separation och isolering av enskilda delmängder av B-celler med hög renhet. Baserat på expressionen av specifika ytreceptorer i olika utvecklingsstadier, mänskliga cirkulerande B-celler är i allmänhet klassificeras i tre huvudunderpopulationer: naiva B-celler (CD19 + CD27 – CD38 -), minnes-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), och PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figur 1). Naiva B-celler av naturen har inte stött på AGS. De kan emellertid differentieras till IgM + CD27 + minnes-B-celler. Även naiva B-celler är homogena uttrycka B-cellsantigenreceptor (BCR) -associated molekyler (t.ex. CD19, CD20 och CD22) de är heterogena i deras immunoglobulin repertoar 5. Majoriteten av CD27 + minnes-B-celler kan differentieras till CD27+ / hi CD38 + PBS / PC 6. Dessutom minnes-B-celler och PBS / PC är polyklonala och uppvisar utvecklande och funktionell heterogenitet 4-7. PBS / datorer i omlopp är normalt kortlivade och inte uttrycka CD138, men de gjorde att slå sig ner i benmärgen kommer terminalt differentiera och bli långlivade. Terminalt differentierade datorer uttrycker CD138 och nedreglera CD27-molekyler på sina ytor 8. Eftersom både PBS och datorer är kapabla att utsöndra Abs, i många tillfällen de kollektivt betecknas som DSK. I motsats härtill kan varken naiva B-celler eller minnes-B-celler producerar avsevärda mängder Abs 9-10. Icke desto mindre, när den isoleras, både naiva och minnes-B-celler kan differentieras till ASCs i 3 – 10 dagar när de placeras i de riktiga odlingsbetingelser 6, 11-15. I själva verket, DSK: er som härrör från in vitro differentiering dela liknande yta uttryck för CD27 och CD38 med de direkt isolerade frOm perifert blod sex. Dessutom DSK: er differentierade in vitro uttrycker en låg nivå av ytan CD20, liknande den i cirkulerande PBS / PC 6. Även om odlingshärledda DSKer är alla kortlivade, kan de utsöndra Abs, vilket indikerar att de är funktionellt behörigt och kan bidra till den humorala immuniteten.
Både ELISA och ELISpot är överlägset de mest tillämpade metoder som man kan få funktionell information om det humorala immunsvaret. ELISA är en 96-brunnars platta-baserad analys, och det används ofta för att mäta de titrar av serum-Ag-specifik Abs och andra analyter (t.ex. cytokiner). Det är bekvämt och skalbar. ELISA används för att använda en fast fas enzymanalys för att detektera närvaron av Abs eller andra ämnen, såsom serum, i ett vätskeprov 16. De avläsning från serum ELISA har använts i stor utsträckning för att representera immunsvaret i kroppen. Ett verktyg som krävs för förvärv av readouts från ELISA-analyser är en spektrofotometrisk mikroplattläsare. Läsaren kan bestämma den optiska densiteten (OD) av slutprodukterna typiskt resulterar från reaktionen av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad detekterings Abs och deras specifika substrat 17. När det gäller att rapportera det humorala immunsvaret, serum Ab nivåer bestäms av ELISA beteckna det kollektiva, men inte individuella, prestanda DSK: er i kroppen. Dessutom ELISA låter att ta hänsyn till den deltagande av minnes-B-celler, vilka inte utsöndrar Abs.
Liksom ELISA, är ELISpot en allmänt använd metod för att detektera och övervaka immunsvar i perifera blodprov 17-18. ELISpot är en teknik relaterad till en sandwich-ELISA. I den, är celler placeras i polyvinylidendifluorid (PVDF) membranstödda brunnar av 96-brunnars mikroplattor för en kortsiktig odling. ELISPOT-analysen är analogt med att utföra western blotting på en mikro och developing fläckarna på PVDF-membranet i varje brunn. krävs ett automatiserat ELISpot läsarsystem eller en stereo för manuell räkning. Den största fördelen med ELISpot vid detektering av ett immunsvar är dess utmärkt känslighet vid kvantifieringen av ASC: er och cytokin-utsöndrande celler. Det rapporterar deras funktionella aktiviteter i humoral och cellulär immunitet, respektive. Vid mätningen av humorala immunförsvar, är serum Ab halter som uppmätts med ELISA och antalet ASC: er räknas upp ELISpot ofta korrelerade, men data avläsning från dessa två analyser har vissa skillnader i funktionella konsekvenser 19-20. Den största fördelen med ELISpot är dess känslighet metod. Nivån av serum Ab-titrar som rapporterats av ELISA presenteras halv kvantitativt som OD avläsningar, som betecknar den relativa Ab nivå, eller mer kvantitativt, eftersom koncentrations avläsning när en känd mängd av rätt isotyperna av Abs ingår som referens. I kontrast, resultaten av ELISpot är presented som det absoluta antalet ASC: er i en cell pool av intresse (t.ex., ofraktionerade perifera mononukleära blodceller (PBMC) och renade B-celler från PBMC). ELISpot kan upptäcka en enda ASC, men ELISA kräver AB uppgår från DSK att nå optimerade analysberoende koncentrationer före mätningen. Därför är ELISpot naturligtvis överlägsen ELISA i känslighet för kvantifiering. Dessutom är ELISpot också lämplig för att kvantifiera de differentierade DSK in vitro från aktiverade minnes-B-celler. Minnes-B-celler inte utsöndrar Abs men kan differentiera till DSKer vid aktivering; De har därför inget bidrag till serum Abs detekteras med ELISA. Således är ELISpot den metod som i mätningen av immunsvaret av cirkulerande minnes B-celler efter aktivering i odling. Det möjliggör övervakning av underhåll på lång sikt humoral immunitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering och rening av humant perifert blod-B-celler
Normalt kan RBC effektivt brista och godkänts av lysbuffert (steg 1,2). Det är viktigt att inte inkubera PBMC med RBC lysisbuffert längre än fem minuter, som cellviabilitet kan påverkas av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC och trombocyter samtidigt avlägsnas genom följande protokoll.
Blanda färskt helblod med syra-citrat-dextros (ACD) buffert (39 mM citronsyra, 75 mM natriumcitrat och 135 mM dextros; pH…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Referencias
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
