Измерение<em> In Vitro</em> Интеграция активность ВИЧ-1 Preintegration Комплексы

ВИЧ-1 репликации в клетке-мишени включает в себя несколько этапов, в широком смысле, сгруппированных в два этапа: ранние и поздние события. Ранние события начинают , когда ВИЧ-1 последовательно связывается с поверхностным рецептором клетки – мишени CD4 и один из двух корецепторами (CCR5 или CXCR4) ^1. Следовательно, вирус-клеточных мембран взрыватель, и вирусный капсид (СА) ядро высвобождается в цитоплазму ^2. Ядро СА содержит вирусную геномную одноцепочечной РНК (ssRNA) и несколько белков, как вирусными и клеточными по своему происхождению. CA-ассоциированных вирусные белки включают обратной транскриптазы (RT) и интегразы (IN), двух ферментов, которые опосредуют важные шаги в ходе ранних событий в репликации вируса. RT и IN функции в контексте нуклеопротеидных комплексов, а именно с обратной транскрипцией комплекс (РТК) и пре-интеграционного комплекса (ПОС), соответственно ^{3, 4, 5} <SUP>, ^6. Концы вирусного генома ssRNA гавани концевого повтора (R) элементов примыкающие к уникальной последовательности U5 (на 5'-конце) и U3 (на 3'-конце). RTC преобразует вирусный геном ssRNA в двухцепочечной (DS) ДНК-копии (vDNA). Этот обратный процесс транскрипции также приводит к дублированию U5 и U3 последовательностей, таким образом , генерируя длинные концевые повторы (LTR) на обоих концах vDNA ^{7, 8.} Впоследствии КВС-ассоциирована в катализирует два последовательных биохимических реакций , которые позволяют интеграцию vDNA в хромосому хозяина ^{9, 10, 11.} Во- первых, в цитоплазме, В мультимеры участвовать оба Ltrs ¹² и расщепляют динуклеотид от каждого из 3'-концевых. Этот 3'-конце обработки генерирует гидроксильную группу на каждом 3'-конце (CA _ОН) от vDNA.Затем ПИК трафиков к ядру, где в использует vDNA CA _ОН в качестве нуклеофильного агента, чтобы отрезать обе нити хромосомной ДНК в шахматном порядке. Одновременно в координационно сростков оба конца vDNA к результирующим фосфодиэфирной связи на противоположных нитей в хромосомную ДНК. После этой стадии переноса цепи, клетка-хозяин машины удаляет два неспаренных нуклеотида на концах 5 'vDNA и ремонт вытекающие отсюда одноцепочечные пробелы на стыке сайта интеграции. Первые события, таким образом, завершаются с созданием интегрированной ДНК-копии (провирусной) от ВИЧ-1 генома. Провирус обеспечивает подходящую среду для эффективной экспрессии вирусного гена, который инициирует последующие события, в том числе экспрессию вирусных-кодируемых белков; сборка незрелого вируса; и подающий надежды, выпуск и созревание в инфекционных вирионов ^13.

Очищенный рекомбинантный ретровирусный В компетентенпроводить в лабораторных условиях , оба вида деятельности для обработки и переноса цепи 3'-конец на экзогенно ДНК LTR-как субстрат. Биохимические исследования с использованием такого очищенного рекомбинантного IN выявили критические аспекты vDNA интеграции ^{14, 15, 16, 17.} Тем не менее, в отличие от естественной инфекции, эта биохимическая реакция в пробирке не поддерживает согласованную интеграцию обоих концов субстратной ДНК в ДНК – мишени. В противоположность этому, ретровирусные ТОС, выделенные из остро инфицированных клеток скоординированно интегрировать оба конца эндогенных vDNA в гетерологичной ДНК-мишени. Это привело к широкому распространению и последующих уточнений Vitro интеграции (IVI) анализов I N с использованием выделенных родных ОСТО.

В первом сообщалось ретровирусов IVI анализа цитоплазматические экстракты из клеток, инфицированных рекомбинантным мышинойЛейкоз Вирус (MLV) укрывает ген кишечной палочки supF в его LTR служил в качестве источника активности IN, и ДНК мутантного фага лямбда неполноценный в литического роста был экзогенно в качестве ДНК – мишени. Успешная интеграция рекомбинантной ДНК MLV скопировать в ДНК фага и последующее supF выражение привело к восстановлению бляшкообразующих способности рекомбинантных фагов. Тем не менее, эта стратегия эксперимента является трудоемким и меры по интеграции косвенным образом. Для решения таких предостережений, Южный непрямое мечение по концам блот на основе, которая квантифицирует ПИК-ассоциированной IVI деятельности в качестве меры эндогенных vDNA интегрированной в экзогенный Линеаризованная бактериофага PHIX174 ДНК, была разработана ^{6, 7, 18.} Хотя этот метод обеспечивает прямое измерение интеграционных мероприятий, относительно высокие количества препарата ПОС необходимы, которая остается сложной техническистремиться. Чтобы обойти это, гнездовой ПЦР на основе анализов , требующих лишь скромные суммы ОСТО были разработаны ^{4, 5, 19.}

В этом докладе мы описываем обновленную версию вложенной ПЦР на основе в пробирке методом изобретенной резюмировать ВИЧ-1 PIC-опосредованного интеграции деятельности , происходящих во время естественной инфекции. Этот метод использует цитоплазматические экстракты ВИЧ-1-инфицированных клеток-мишеней в качестве источника эндогенного PIC активности, которая измеряется в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР). Процедуры выделения ОСТО и измерения их деятельности по интеграции адаптированы, с изменениями, из протоколов , опубликованных в лаборатории Engelman ^20. В этом методе, интегрирование активности ПОС-ассоциированной инициируется путем создания ДНК – мишени экзогенной линейный ^21, и продукты ДНК в результатеэта реакция интеграции очищают и используют в качестве исходного материала для последующего ПЦР-квантификации. В первом раунде обычной ПЦР, стыки ДНК вирусно-мишени амплифицируют с использованием соответствующих праймеров. Во втором раунде КПЦР, LTR-специфические праймеры используются специально обогащают популяцию vDNA от первого раунда ПЦР-продуктов. Пожалуйста, смотрите раздел протокола для подробного описания этого метода.

В пробирке исследования с ретровирусных ОСТО привели к значительному прогрессу в понимании механизма интеграции ретровируса ДНК и в разработке ингибиторов IN. На основе недавнего повышенного внимания отображение ВИЧ-1 интеграции сайтов, определение роли вирусных и принимающих факторов у ВИЧ-1 интеграции, а также разработки новых противовирусных препаратов на борьбу с лекарственной устойчивостью, мы предусматриваем повышенный интерес и широкое применение IVI анализов , как описанный в настоящем докладе. Это, в свою очередь, приведет кбудущих уточнений в методе, таким образом, диверсифицировать сферу ее применения.