Denne protokol beskriver, hvordan man pode C57BL / 6J mus med EGD-stamme af Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) og måle interferon-γ (IFN-γ) responser ved naturlig dræber (NK) celler, naturlige dræber T (NKT) celler, og adaptive T-lymfocytter efter infektion. Denne protokol beskrives også hvordan man fører overlevelse hos mus efter infektion med en modificeret LD50 dosis af patogenet.
L. monocytogenes er en grampositiv bakterie, der er årsag til fødevarebårne sygdomme hos mennesker. Eksperimentel infektion af mus med dette patogen har været yderst informativ om den rolle, medfødte og adaptive immunceller og specifikke cytokiner i værten immunitet mod intracellulære patogener. Produktion af IFN-γ med medfødte celler under subletale infektion med L. monocytogenes er vigtig for aktivering makrofager og tidlig kontrol af patogenet 1-3. Desuden IFN-γ-produktion af adaptive hukommelse lymfocytter er vigtigt for priming aktiveringen af medfødte celler efter reinfektion 4. Den L. monocytogenes infektion model tjener således som et godt værktøj til at undersøge, om nye behandlingsformer, der er designet til at øge IFN-γ produktion har en indvirkning på IFN-γ reaktioner in vivo og har produktive biologiske effekter såsom øget bakteriel clearance eller forbedre mus overlevelse frainfektion. Beskrevet her er en grundlæggende protokol for hvordan man fører intraperitoneale infektioner af C57BL / 6J mus med EGD-stamme af L. monocytogenes og måle IFN-γ-produktion af NK-celler, NKT-celler og adaptive lymfocytter ved flowcytometri. Derudover er procedurer beskrevet til: (1) vokse og forberede bakterierne til podning, (2) måling af bakteriel belastning i milten og leveren, og (3) at måle dyr overlevelse til endepunkter. Repræsentative data er også tilvejebragt for at illustrere, hvordan denne infektion model kan anvendes til at teste virkningen af specifikke midler på IFN-y reaktioner på L. monocytogenes og overlevelsen af mus fra denne infektion.
IFN-γ er et cytokin, der er afgørende for mediering af immunitet mod intracellulære patogener og til at styre tumor 5 vækst. Betydningen af dette cytokin i bakteriel resistens er tydeligt i den iagttagelse, at mennesker med mutationer i IFN-γ-signalvejen er stærkt modtagelige for infektion med mycobakterier og salmonella 6. Tilsvarende mus defekte i enten IFN-γ eller IFN-γ-receptor udviser defekter i resistens over for mycobakterier 7-9 og andre intracellulære patogener, herunder L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, og visse vira 11. Foruden bekæmper patogener, IFN-γ spiller en afgørende rolle i vært-forsvar mod tumorer 14. Selvom højere produktion af IFN-γ er gavnlig i forbindelse med infektion eller cancer, har forlænget produktion af dette cytokin blevet forbundet to udvikling af systemisk autoimmunitet 15-17 og accelerationen af type I-diabetes i den ikke-overvægtige diabetiske musemodel 18.
De vigtigste kilder til IFN-γ omfatter NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler, T hjælper 1 (Th1) -celler, og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 5,19,20. IFN-γ forbedrer både medfødte og adaptive immunitet ved: (1) opregulering hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II udtryk, (2) at øge ekspressionen af co-stimulerende molekyler på antigen-præsenterende celler, (3) at øge makrofag fagocytose og produktionen af pro-inflammatoriske cytokiner og mikrobicide faktorer (f.eks nitrogenoxid og reaktive oxygenarter), (4) fremme differentieringen af naive CD4 + T celler til Th1-effektorceller, (5) fremme antistof klasseskift til immunglobulin ( Ig) 2a og IgG3 (i mus), (6) induktion af produktion af kemokiner at rekruttere immunceller til steder med infection, og (7) forbedring NK celle og CTL-reaktioner 5,19. I betragtning af den afgørende betydning af IFN-γ i værtens reaktion på patogener og tumorer, har rekombinant IFN-γ blevet testet som en behandling for forskellige infektioner og maligniteter (anmeldt i 19). Men fordi systemisk indgivelse af IFN-γ eller Th1 fremme cytokin interleukin-12 (IL-12) er forbundet med bivirkninger og dosis-relateret toksicitet 19,21, der er interesse for at udvikle alternative strategier til at øge IFN-γ-produktion ved immunceller. Udvikling af nye biologiske lægemidler og små molekyler kræver in vivo screening-værktøjer til at teste, om sådanne midler øger IFN-γ produktion i et immunrespons, og hvorvidt dette udmønter sig i meningsfulde biologiske effekter såsom stigninger i dyr overlevelse.
Eksperimentel infektion af mus med de gram-positiv bakterie L. monocytogenes har været en medvirkende model fordechifrering rolle IFN-γ i vært-immunitet mod intracellulære patogener 1,22. Infektion af mus med patogenet intravenøst eller intraperitonealt (ip) fører til hurtig udbredelse af bakterier til milt og lever, hvor de bliver internaliseret af residente makrofager og hepatocytter med peak bakterielle belastninger i milten forekommer mellem 3 og 4 dage post infektion 1,3,22. Produktion af IFN-γ af NK-celler er vigtig for makrofagaktivering og tidlig resistens mod patogenet 3; dog ved høje infektiøse doser, kan produktion af IFN-γ også være skadelig for patogen feltet 23. NKT-celler er også en kilde til IFN-γ i milt og lever under tidlig kontrol af patogener 2,24 og denne produktion er blevet vist at forstærke IFN-γ-produktion af andre celletyper, herunder NK-celler 2. På den anden side, senere virkende adaptive T-lymfocytter, CD8 + T-celler i deltaCULAR, er vigtige for at mægle clearance af patogenet og yde beskyttelse mod reinfektion 1,4,22.
Denne infektion model har været attraktivt for forskere for en række årsager (revideret i 1). Første, infektion med patogenet er meget reproducerbar og inducerer et stærkt Th1 og cellulært immunrespons. For det andet under subletal infektion, er bakteriel belastning koncentreres i leveren og milten, hvor den let kan måles. For det tredje kan patogenet håndteres sikkert under biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) betingelser. For det fjerde organismen og den immunrespons, som det genererer er blevet grundigt karakteriseret. Endelig har en række mutante og genetisk modificerede stammer blevet udviklet, som er tilgængelige til brug.
Beskrevet her er en grundlæggende protokol for podning af C57BL / 6J mus med EGD stamme af L. monocytogenes 25 og til måling af IFN – γ rebesvarelser fra NK, NKT, og adaptive lymfocytter efter infektion. Der beskrives også, hvordan man måler bakteriel belastning i milten og leveren efter subletale infektion og til at udføre overlevelsesstudier efter infektion med en modificeret LD50 dosis af patogenet. Endelig er repræsentative data vist, hvordan denne protokol kan anvendes til at screene virkningen af nye behandlinger på IFN-y-responser og muse overlevelse fra L. monocytogenes infektion.
Her beskriver vi en protokol over, hvordan at foretage en grundlæggende eksperimentel infektion med EGD stamme af L. monocytogenes 25 i mandlige eller kvindelige C57BL / 6J mus. Denne protokol blev oprettet med det formål at studere effekten af en ny lille molekyle IS001 på IFN-γ produktion af medfødte og adaptive lymfocytter in vivo 31. Ved at overvåge bakterieclearance og overlevelse efter infektion blev indsigter i hvordan disse ændringer i IFN-γ påvirket værtens evne…
The authors have nothing to disclose.
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
Bleach | For decontamination | ||
70% Ethanol | For decontamination | ||
Glass beads | any brand should be appropriate | ||
Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
Pipette | any brand should be appropriate | ||
Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
FACs tubes | BD | ||
BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |