的pH依赖性活性的检测<em>大肠杆菌</em>陪护HdeB<em>体外</em>和<em>在体内</em
Summary
这项研究说明生物物理，生物化学和分子生物学技术的酸性pH条件下表征大肠杆菌 HdeB的伴侣活性。这些方法已被成功地用于其它酸保护伴侣分子如HdeA蛋白，并且可以进行修改，以用于其它分子伴侣和应力的条件下工作。
Abstract
细菌经常暴露于环境的变化，如在pH值改变，温度，氧化还原状态，光照射或机械力。许多的这些条件导致蛋白质在细胞中解折叠和对生物体的存活有害影响。 A组无关，特定的应力 – 分子伴侣已被证明在这些胁迫条件存活中发挥重要作用。虽然完全折叠和分子伴侣不活动的压力之前，这些蛋白质迅速展开和具体的胁迫下成为伴侣活性。一旦被激活，这些条件无序伴侣结合到大量不同的聚集倾向的蛋白质，防止其聚集和直接或间接地促进蛋白在返回到非胁迫条件重折叠。对于获得关于它们的激活和客户识别的机理的更详细的了解主方法涉及纯化和subsequen使用体外实验伴侣这些蛋白质的牛逼表征。后续体内应激试验是绝对必要的独立证实体外结果所获得的。
这个协议描述的体外 和体内方法来表征E的伴侣活性大肠杆菌 HdeB，酸活化的蛋白伴侣。光散射测量被用来作为一种方便读出为HdeB的能力，以防止已建立的模型客户蛋白，MDH的酸诱导的聚集， 在体外 。分析超速离心实验应用于揭示HdeB及其客户蛋白LDH之间形成复合物，轻脱落到客户蛋白在返回非重压条件下的命运。的客户蛋白的酶促活性测定法进行监测HdeB的pH值引起的客户端的失活和活化的影响。最后，存活研究被用来monito中的R 体内 HdeB的陪伴分子功能的影响。
Introduction
其中微生物病原体经历酸诱导蛋白展开条件常见的自然环境是哺乳动物的胃（pH范围1-4），其酸性pH值作为对食源性致病菌1的有效屏障。蛋白质解折叠和聚集，这是由氨基酸侧链质子化引起的，会影响生物过程，损害的细胞结构，并最终导致细胞死亡1,2。因为细菌周质的pH值达到平衡几乎瞬间与环境pH值由于通过多孔外膜质子的自由扩散，革兰氏阴性细菌的周质和内膜蛋白是酸胁迫条件3下的最脆弱的细胞成分。以保护其免于快速酸介导的损伤的周质蛋白质，革兰氏阴性细菌利用酸活化周质蛋白伴侣HdeA蛋白和HdeB。 HdeA蛋白是一种有条件的无序伴侣<sup> 4,5：在中性pH值，HdeA蛋白是作为折叠，分子伴侣惰性二聚体。当pH值低于转变pH值为3，HdeA蛋白的分子伴侣功能被快速激活6,7。 HdeA蛋白激活需要深刻的结构变化，包括其解离成单体，和部分解折叠的单体6-8。一旦被激活，HdeA蛋白结合到酸性条件下展开的蛋白质。它有效地防止了两者在pH中和过程中在低pH孵育以及它们的聚集。在返回至pH7.0，HdeA蛋白有利于在ATP无关的方式其客户蛋白质复性和转换回它的二聚体，分子伴侣活性构象9。同样地，同源伴侣HdeB也伴侣惰性在pH 7.0。不像HdeA蛋白，然而，HdeB的分子伴侣活性在pH值4.0达到其最大表观，其下HdeB在很大程度上仍然折叠和二聚体10的条件。而且，进一步降低pH CAUSES HdeB的失活。这些结果表明，尽管其广泛的同源性，HdeA蛋白和HdeB在它们的功能的激活允许它们以覆盖一个宽的pH范围内与它们的保护陪伴分子功能的方式有所不同。已经在大肠杆菌中的耐酸性牵连一种其它分子伴侣大肠杆菌是胞质Hsp31，这似乎直到恢复中性条件下稳定折叠客户蛋白。 Hsp31的行动的确切模式，但是，一直保持神秘的12。鉴于其他致肠病细菌如沙门氏菌缺乏hdeAB操纵子，它很可能是其他尚未鉴定的周质蛋白伴侣可能存在是参与这些细菌11的耐酸性。
这里介绍的协议允许监测体外和体内 10 HdeB的pH依赖性伴侣活性和可应用于研究其他分子伴侣如Hsp31。或者，控制hdeAB的表达转录因子的复杂网络可以潜在地通过在体内应力测定法研究。为了表征体内蛋白的分子伴侣功能，不同的实验设置可以被应用。一路线是应用蛋白质折叠应激条件和表型表征突变菌株，无论是过表达感兴趣的基因或者携带缺失的基因。蛋白质组学研究可以进行到聚合识别哪些蛋白不再胁迫条件下时，分子伴侣存在时，或者可以在使用酶测定14-16应力条件来确定一个伴侣上的特定的酶的影响。在这项研究中，我们选择了过度HdeB在rpoH缺失株，它缺乏热休克σ因子32 RpoH控制所有主要E.表达大肠杆菌伴侣及其缺失是已知会增加SENSitivity到导致蛋白质折叠15环境胁迫条件。 HdeB 的体内伴侣活性通过监测其抑制ΔrpoH应变的pH敏感性的能力来确定。总之，这里介绍的协议提供了快速并简单的方法来表征体外以及在体内上下文酸活化的分子伴侣的活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了研究活化和HdeB的伴侣功能的机制，大量HdeB的必须被表达和纯化。许多表达载体系统可用于生产高水平的靶蛋白，包括的pTrc或的pBAD载体，这两者在此研究中使用的。发起人是E.容易获得大肠杆菌 RNA聚合酶和在任何大肠杆菌 HdeB的从而允许强烈上调表达大肠杆菌菌株。这方面是用于酸应力的条件下，在这里被使用的rpoH缺损株下HdeB的体内表达研究尤?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢克劳迪娅Cremers博士为她的伴侣测定有益的建议。啃完被确认为HdeB净化自己的技术援助。这项工作是由霍华德·休斯医学研究所（到JCAB）和健康补助RO1 GM102829到JCAB和UJJ-UD全国学院是由德国研究基金会（DFG）提供的博士后研究奖学金支承。
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
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