के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने<em> कोलाई</em> निगरानी HdeB<em> इन विट्रो</em> और<em> Vivo</em
Summary
इस अध्ययन अम्लीय पीएच की शर्तों के तहत कोलाई HdeB की निगरानी गतिविधि को चिह्नित करने के लिए, biophysical जैव रासायनिक और आणविक तकनीक का वर्णन है। इन विधियों सफलतापूर्वक ऐसी HdeA के रूप में अन्य एसिड सुरक्षात्मक chaperones के लिए लागू किया गया है और अन्य chaperones और तनाव की स्थिति के लिए काम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
Abstract
जीवाणु अक्सर इस तरह के पीएच में परिवर्तन, तापमान, redox स्थिति, प्रकाश जोखिम या यांत्रिक शक्ति के रूप में पर्यावरण परिवर्तन, के संपर्क में हैं। इन स्थितियों के कई प्रोटीन कोशिका में खुलासा कारण और जीव के अस्तित्व पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है। असंबंधित, तनाव-विशिष्ट आणविक chaperones के एक समूह ने इन तनाव की स्थिति के अस्तित्व में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। पूरी तरह से मुड़ा और निगरानी-निष्क्रिय तनाव से पहले, ये प्रोटीन तेजी से प्रकट करना और विशिष्ट तनाव की स्थिति के तहत निगरानी सक्रिय हो जाते हैं। एक बार सक्रिय, इन सशर्त अव्यवस्थित chaperones अलग एकत्रीकरण की आशंका वाले प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के लिए बाध्य है, उनके एकत्रीकरण को रोकने और या तो सीधे या परोक्ष रूप से गैर-तनाव की स्थिति में लौटने पर refolding प्रोटीन की सुविधा। उनकी सक्रियता और ग्राहक मान्यता के तंत्र के बारे में अधिक विस्तृत समझ पाने के लिए प्राथमिक दृष्टिकोण शुद्धि और subsequen शामिलइन विट्रो निगरानी assays में उपयोग करते हुए प्रोटीन की टी विशेषता। विवो तनाव assays में अनुवर्ती स्वतंत्र रूप से इन विट्रो परिणामों में प्राप्त की पुष्टि करने के लिए जरूरी हैं।
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो और इन विवो तरीकों में वर्णन ई की निगरानी गतिविधि को चिह्नित करने के लिए कोलाई HdeB, एक एसिड सक्रिय निगरानी। प्रकाश बिखरने माप इन विट्रो में, एक की स्थापना मॉडल ग्राहक प्रोटीन, MDH की एसिड प्रेरित एकत्रीकरण को रोकने के लिए HdeB की क्षमता के लिए एक सुविधाजनक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में इस्तेमाल किया गया। विश्लेषणात्मक ultracentrifugation प्रयोगों HdeB और उसके ग्राहक प्रोटीन LDH के बीच जटिल गठन प्रकट करने के लिए, गैर तनाव की स्थिति के लिए उनकी वापसी पर ग्राहक प्रोटीन के भाग्य में प्रकाश डाला करने के लिए लागू किया गया। ग्राहक प्रोटीन के enzymatic गतिविधि assays पीएच प्रेरित ग्राहक निष्क्रियता और पुनर्सक्रियन पर HdeB के प्रभाव पर नजर रखने के लिए आयोजित की गई। अंत में, अस्तित्व के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया monitoविवो में HdeB की निगरानी समारोह के प्रभाव आर।
Introduction
एक आम प्राकृतिक वातावरण में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों एसिड प्रेरित प्रोटीन खुलासा परिस्थितियों का अनुभव स्तनधारी पेट (पीएच रेंज 1-4), जिसका पीएच अम्लीय खाद्य जनित रोगजनकों 1 के खिलाफ एक प्रभावी बाधा के रूप में कार्य करता है। प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण, जो एमिनो एसिड पक्ष श्रृंखला protonation के कारण होता है, जैविक प्रक्रियाओं, नुकसान सेलुलर संरचनाओं को प्रभावित करता है और अंत में कोशिका मृत्यु 1,2 कारण बनता है। चूंकि जीवाणु periplasm का पीएच झरझरा बाहरी झिल्ली के माध्यम से प्रोटॉन की मुक्त प्रसार के कारण पर्यावरण पीएच के साथ लगभग तुरंत equilibrates, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की periplasmic और भीतर की झिल्ली प्रोटीन एसिड तनाव की स्थिति 3 के तहत सबसे कमजोर सेलुलर घटक हैं। तेजी से एसिड की मध्यस्थता क्षति के खिलाफ उनकी periplasmic proteome की रक्षा करने के लिए, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया एसिड सक्रिय periplasmic chaperones HdeA और HdeB का उपयोग। HdeA एक सशर्त बेक़ायदा निगरानी है <sup> 4,5: तटस्थ पीएच, HdeA एक मुड़ा हुआ, निगरानी-निष्क्रिय डिमर के रूप में मौजूद है। 3 पीएच नीचे एक पीएच पारी पर, HdeA की निगरानी समारोह जल्दी से 6.7 सक्रिय है। HdeA के एक्टिवेशन monomers में अपनी हदबंदी सहित गहरा संरचनात्मक परिवर्तन, और आंशिक monomers 6-8 का खुलासा आवश्यकता है। एक बार सक्रिय, HdeA प्रोटीन है कि अम्लीय परिस्थितियों में प्रकट करने के लिए बांधता है। इसे प्रभावी ढंग से दोनों कम पीएच पर ऊष्मायन के दौरान के रूप में अच्छी तरह से पीएच निराकरण पर उनके एकत्रीकरण रोकता है। पीएच 7.0 में लौटने पर, HdeA एक एटीपी स्वतंत्र ढंग से अपने ग्राहक प्रोटीन की refolding की सुविधा और इसकी dimeric, निगरानी-निष्क्रिय रचना 9 में वापस धर्मान्तरित। इसी तरह, मुताबिक़ निगरानी HdeB भी निगरानी-निष्क्रिय पीएच 7.0 पर है। HdeA विपरीत, तथापि, HdeB की निगरानी गतिविधि इसकी स्पष्ट अधिकतम पीएच 4.0 पर, जिन स्थितियों HdeB अभी भी काफी हद मुड़ा और dimeric 10 तक पहुँचता है। इसके अलावा, आगे पीएच caus घटानेतों HdeB की निष्क्रियता। इन परिणामों का सुझाव है कि उनके व्यापक अनुरूपता के बावजूद, HdeA और HdeB कार्यात्मक सक्रियण उन्हें उनकी सुरक्षा निगरानी समारोह के साथ एक व्यापक पीएच रेंज को कवर करने के लिए अनुमति के अपने मोड में मतभेद है। एक अन्य निगरानी कि ई का एसिड प्रतिरोध में फंसाया गया है कोलाई cytoplasmic Hsp31, जो सामने आया ग्राहक प्रोटीन स्थिर करने के लिए जब तक तटस्थ की स्थिति बहाल कर रहे हैं प्रकट होता है। Hsp31 की कार्रवाई की सटीक विधा है, हालांकि, रहस्यपूर्ण 12 रह गया है। यह देखते हुए कि इस तरह के साल्मोनेला बैक्टीरिया के रूप में अन्य enteropathogenic hdeAB operon की कमी है, यह बहुत संभावना है कि अन्य अभी तक अज्ञात periplasmic chaperones मौजूद हो सकता है कि इन जीवाणुओं 11 की एसिड प्रतिरोध में शामिल हो रहा है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन विट्रो और इन विवो 10 में HdeB का पीएच निर्भर निगरानी गतिविधि पर नजर रखने के लिए अनुमति देते हैं और अन्य chaperones जांच करने के लिए लागू किया जा सकताHsp31 के रूप में इस तरह के। वैकल्पिक रूप से, प्रतिलेखन कारक है कि hdeAB की अभिव्यक्ति को नियंत्रित के जटिल नेटवर्क संभवतः इन विवो तनाव परख द्वारा जांच की जा सकती है। विवो में प्रोटीन की निगरानी समारोह को चिह्नित करने के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक setups के लिए लागू किया जा सकता है। एक मार्ग प्रोटीन खुलासा तनाव की स्थिति लागू करने के लिए और phenotypically उत्परिवर्ती उपभेदों है कि या तो ब्याज की जीन overexpress या जीन की एक विलोपन ले जाने के लिए चिह्नित है। प्रोटिओमिक पढ़ाई के तनाव की स्थिति के तहत कुल जो प्रोटीन की पहचान करने के लिए नहीं रह गया है जब निगरानी मौजूद है आयोजित किया जा सकता है, या एक विशेष एंजाइम पर एक निगरानी के प्रभाव तनाव की स्थिति एंजाइमी assays 14-16 उपयोग करने के दौरान निर्धारित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम एक rpoH विलोपन तनाव है, जो गर्मी के झटके सिग्मा कारक 32. RpoH सभी प्रमुख ई की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता अभाव में HdeB overexpress करने के लिए चुना कोलाई chaperones और उसके विलोपन Sens बढ़ाने के लिए जाना जाता हैपर्यावरण के तनाव की स्थिति का कारण है कि प्रोटीन खुलासा करने के लिए 15 itivity। HdeB के vivo निगरानी गतिविधि Δ rpoH तनाव का पीएच संवेदनशीलता को दबाने के लिए अपनी क्षमता की निगरानी के द्वारा निर्धारित किया गया था। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तेजी से और सीधा विट्रो में और साथ ही इन विवो संदर्भ में एक एसिड सक्रिय निगरानी की गतिविधि को चिह्नित करने के लिए दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सक्रियण और HdeB की निगरानी समारोह की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए, HdeB की बड़ी मात्रा में व्यक्त की और शुद्ध किया जाना है। अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणालियों के एक नंबर एक लक्ष्य प्रोटीन का उच्च स्तर, pTrc या pBAD ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम निगरानी assays पर उसे उपयोगी सलाह के लिए डॉ क्लाउडिया Cremers धन्यवाद। केन वान HdeB शुद्धि में अपने तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार किया है। इस काम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (JCAB के लिए) और JCAB और UJJ उद स्वास्थ्य अनुदान RO1 GM102829 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) द्वारा उपलब्ध कराए गए एक postdoctoral शोध फैलोशिप द्वारा समर्थित है।
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
Referencias
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