Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Além do genoma nuclear, cada célula eucariótica também contém milhares de cópias de DNA circular pequena na matriz mitocondrial. Enquanto DNA mitocondrial (mtDNA) codifica subunidades essenciais da cadeia de transporte de electrões, a maioria do proteoma mitocondrial, incluindo todos os factores de replicação e transcrição de mtDNA são codificados pelo genoma nuclear. Em contraste com o genoma nuclear que segue as leis da hereditariedade mendeliana, o genoma mitocondrial animais é herdado exclusivamente através da linhagem materna. Portanto, compreender como mtDNA é proliferaram e transmitida de uma geração para a outra através do oócito feminino é de fundamental importância. No entanto, há um debate contínuo sobre a forma como a replicação mtDNA é regulada na linha germinativa feminina. Além disso, a teoria gargalo mtDNA amplamente aceites para a transmissão de mtDNA sugere que a população de mtDNA em células germinativas primordiais é sub-amostrado a um número relativamente pequeno durang desenvolvimento 1 2. Implica também que a replicação do mtDNA é temporal e espacialmente regulamentado durante oogenesis. Assim, a detecção in situ de replicação mtDNA durante o desenvolvimento da linha germinativa irá facilitar a compreensão do mecanismo de herança mtDNA.
Drosophila oogenesis fornece um sistema geneticamente tratável para estudar a replicação mtDNA e transmissão. Em cada um dos dois ovários de Drosophila, existem 16-20 cadeias independentes de câmaras de ovo chamados ovarioles 3, que são as unidades funcionais de produção de ovos (ver Figura 1A). Cada ovaríolo contém uma organização linear progressiva de oog�ese, onde a ponta anterior é composto de uma estrutura chamada germário. O germário é ainda dividido em quatro regiões que contêm as células germinativas em diferentes estágios de desenvolvimento. Na região 1, as células-tronco germinativas passam por divisão assimétrica para produzir células filhas conhecidos como cystoblasts. Região 2a contém os cistoblastos que tenham concluído a sua divisão final. Cistoblastos sofrer quatro rodadas de grupos de 16 Divisão Celular produzindo. As células 16 permanecem ligadas umas às outras por pontes citoplasmáticas chamados canais de anel. Apenas uma das células compromete-se a diferenciação como o oócito, enquanto o outro 15 desenvolver-se como células poliplóides enfermeira. Uma estrutura citoplasmática essencial, conhecido como fusoma, é proposto para facilitar com a formação de canais de anel, determinar a polaridade cisto e a enfermeira interacções célula-oócitos 4,5. Como os cistos avançar para 2b região, as estruturas de quisto abranger toda a largura do germário, e tornar-se mais associado com as células do folículo. As estruturas germário acabar com a região 3 que contém a primeira câmara de ovo brotamento. Subsequentemente, as câmaras de ovo são montados na extremidade posterior da germário, que progridem através do ovaríolo em 14 etapas morfologicamente distintas. O crescimento do oócito depende das células enfermeira, WHproteínas de transporte ich, mRNA e estruturas endomembrane (por exemplo, de Golgi) através dos canais de anel para o oócito. Durante Drosophila oog�ese, verificou-se que uma fracção de mitocôndrias em cada cisto 16 células foram associados com a fusoma, mudou-se através dos canais de anel e foram entregues no único oócito em uma grande massa chamada Balbiani corpo 6. Este fenômeno foi proposta para contribuir para o controle de qualidade de herança mitocondrial através de ovários femininos.
Detecção de síntese mtDNA baseia-se na incorporação de precursores de ADN marcados no ADN celular. Tradicionalmente, um análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) foi utilizado para marcar o mtDNA de replicação em células de cultura de tecidos de 7,8. No entanto, a rotulagem BrdU à base de anticorpo apresenta várias limitações, especialmente para a coloração de tecidos whole-mount. Uma grande desvantagem da marcação com BrdU é que requer a desnaturação do ADN para exporo epitopo de BrdU, de modo que pode ser detectada pelo anticorpo anti-BrdU. A amostra tem que ser tratada sob condições de desnaturação duras, tais como produtos químicos (por exemplo, ácido clorídrico ou misturas de metanol e ácido acético), calor, ou digestão com ADNase, o que poderia interromper a estrutura da amostra e complicam o seguinte procedimento de coloração 9, 10.
Aqui, uma alternativa timidina análogo 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é utilizado para marcar o ADN mitocondrial replicar em ovários adulto de Drosophila. Este método é mais rápido e altamente sensível. EdU é prontamente incorporado no ADN celular durante a replicação do ADN. A detecção que se segue baseia-se numa reacção "clique", Cu (I) catalisada por reacção covalente entre o grupo alcino terminal e uma azida fluorescente 10. Uma vez que a reacção não requer a desnaturação do espécime, que permite uma boa conservação estrutural. Além disso, o tamanho de um coranteZide só é 1/500 de que uma molécula de anticorpo de 10, o que permite a penetração rápida e eficiente de tecidos conjunto de montagem. Temos utilizado este método para detectar replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis e encontrou um padrão espacial marcante na região germário de Drosophila ovário 11, o que nos levou a propor um mecanismo de herança mtDNA seletiva dependentes de replicação. Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado sobre rotulagem EdU da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila. Para demonstrar a aplicação do protocolo, que também testou a replicação do mtDNA em mtDNA mutante de Drosophila (mt: CoI T300I) 11, bem como com o tratamento de diversas desacopladores mitocondriais, que dissipam o potencial de membrana mitocondrial e, potencialmente, perturbam a replicação do mtDNA.
EdU rotulagem é um método novo e eficiente para detectar a síntese de DNA em células em proliferação, o que é baseada na incorporação de coloração e de análogos de nucleósidos em ADN recém-sintetizado. Este método é superior para o método de marcação com BrdU na medida em que é mais rápido e altamente sensível. Mais importante, ele permite uma boa preservação estrutural e eficiente penetração EDU-corante de tecidos conjunto de montagem 9, 10. Historicamente, como uma alternativa superior para marcação com BrdU, a rotulagem EdU foi utilizado para estudar a replicação do ADN nuclear durante a fase S do ciclo de célula. A afidicolina é um inibidor de α ADN-polimerase, que é o principal polimerase para a replicação do ADN nuclear em fase S 12 15. replicação mtDNA é realizada por γ ADN-polimerase, que é insensível ao tratamento afidicolina. Assim, o tratamento com afidicolina, antes e durante a incubação EdU inibiu significativamente EdU incorporação no ADN nuclear. Deveria-se notar que a afidicolina possa ser estável durante várias semanas, se apropriadamente armazenada, e a eficácia da afidicolina na inibição da replicação do ADN nuclear foi variável nas nossas mãos. Os ovarioles ou câmaras de ovo com rotulagem DNA nuclear forte devem ser excluídos da análise de novos dados.
replicação mtDNA pode ser facilmente visualizado como pontos lacrimais no citoplasma, que também proporciona uma maneira simples para quantificar o nível de replicação do mtDNA por contagem do número de pontos lacrimais EdU, normalizada para o volume total do citoplasma. software de imagem pode ser aplicado para identificar automaticamente EdU pontos lacrimais em imagens microscópicas, o que é especialmente útil para análises computacionais de grandes conjuntos de dados. No entanto, devem ser tomadas precauções, porque a inibição incompleta da replicação do ADN nuclear pode levar à incorporação EdU em loci distintos no cromossoma e exibir como pontos lacrimais dentro do núcleo. Também, em outros casos, a intensidade de incorporação EdU replicando mtDNA pode ser fraca, enquanto o fundo e ruído pode ser alto. Portanto, os parâmetros individuais para análises automáticas de imagem deve ser cuidadosamente definido. Também é recomendado que as imagens devem ser examinadas com os olhos treinados para se certificar de que adequada puncta EdU são identificados.
Visualização de mtDNA recém-sintetizado durante Drosophila oogenesis oferece uma oportunidade para investigar como a replicação mtDNA é regulado sob condições fisiológicas ou patológicas, realizando o experimento em moscas sujeitas a uma variedade de perturbações farmacológicas ou genéticas. Em um estudo anterior, ensaio de incorporação EdU foi realizado em uma mtDNA mutante Drosophila mt: CoI T300I 11. Além disso, a perturbar o potencial de membrana mitocondrial, ovários foram tratadas com várias concentrações de FCCP desacoplador mitocondrial ou 2,4-dinitrofenol (DNP), antes da incorporação EdU. Dependendo dos fins experimentaise as características de drogas, pode ser adotado diferentes métodos para a entrega eficaz. Para moscas adultas, as drogas podem ser apresentadas como um vapor (por exemplo, etanol e cocaína) 16,17 drogas ou pode ser injectado no abdómen, onde rapidamente difunde-se por todo o corpo 18. A prática mais comum é que as drogas são adicionados ao alimento ou uma mosca / papel de filtro saturado com a droga sacarose. Por exemplo, o inibidor de montagem de microtúbulos, colchicina, foi alimentada para moscas durante 2-3 dias antes da dissecação do ovário 19. Por isso, é importante para avaliar o método de administração de fármaco e escolher as concentrações apropriadas.
Para garantir a imagem de sucesso da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila, vários passos críticos devem ser cuidadosamente executado. Acima de tudo, preservar a viabilidade ea saúde dos ovários durante a dissecção e Edu incorporação é essencial (etapas 1 e 2). O meio de Drosophila de Schneider com FBS precisa de ser aquecida até à TAantes de usar. Deve-se minimizar o contato direto entre as câmaras de ovos e ferramentas de dissecação ou pontas de pipeta. Os ovários deve ser imersa a soluções de todos os tempos para evitar a desidratação. O manuseio incorreto dos tecidos podem facilmente levar a desmaiar ou nenhuns sinais fluorescentes. Durante o passo de montagem do tecido, ovarioles devem ser separados uns dos outros e espalhar-se sobre a lâmina de microscópio. Certifique-se as câmaras de ovos não são empilhados em cima uns dos outros. Notamos que as câmaras de ovos para além fase 14 demonstrou pouca incorporação EdU. Além disso, por causa do tamanho grande, as câmaras de ovos fase tardia, muitas vezes fazer com que os vizinhos câmaras de ovos mais jovens a ficar fora de foco. Assim, recomenda-se que as câmaras de fase final de ovo ser descartado.
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a rotulagem replicar mtDNA nos ovários adultos Drosophila. Este método permite a simples quantificação de replicação mtDNA sob várias perturbações genéticas e farmacológicas,e será útil para dissecar os mecanismos subjacentes biogênese mitocondrial desenvolvimento e herança mtDNA.
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |