Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Daryl Sivakumaran; Emilia Bakaic; Scott B. Campbell; Fei Xu; Eva Mueller; Todd Hoare

doi:10.3791/54502

JoVE Journal > Bioengineering

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Bioingeniería

Fabrication des Thermoresponsive Hydrogels dégradable sur plusieurs échelles de longueur par Extrusion réactive, microfluidique, auto-assemblage et électrofilage

Published: April 16, 2018

doi:

10.3791/54502

Daryl Sivakumaran¹, Emilia Bakaic¹, Scott B. Campbell¹, Fei Xu¹, Eva Mueller¹, Todd Hoare¹

¹Department of Chemical Engineering,McMaster University

Summary

Les protocoles sont décrits pour la fabrication des hydrogels biodégradables thermoresponsive basés sur hydrazone réticulation de polymères oligomères sur la balance en vrac a petite Echelle, échelle nanométrique et ce dernier pour la préparation de nanoparticules de gel et de nanofibres.

Abstract

Alors que divers matériaux intelligents ont été explorées pour une variété d’applications biomédicales (p. ex., MEDICAMENTS, génie tissulaire, bio-imagerie, etc.), leur utilisation clinique ultime a été entravée par le manque de biologiquement pertinentes dégradation observée pour les matériaux plus intelligents. Cela est particulièrement vrai pour les température hydrogels, qui reposent presque uniformément sur les polymères qui sont fonctionnellement non dégradables (par exemple, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) ou poly (méthacrylate de glycol d’oligoéthylène) (POEGMA) ). Par conséquent, pour effectivement traduire le potentiel des hydrogels thermoresponsive aux défis de la délivrance des médicaments télécommandé ou réglementées du métabolisme, cellule échafaudages avec des interactions cellule-matériau accordables, théranostiques matériaux avec le potentiel pour l’imagerie et medicaments et ces autres demandes, une méthode est nécessaire pour restituer les hydrogels (si pas entièrement dégradable) au moins capable de la clairance rénale suite à la durée de vie exigée du matériau. À cette fin, ce protocole décrit la préparation d’hydrogels hydrolytiquement-dégradables hydrazone-RETICULE sur plusieurs échelles de longueur basées sur la réaction entre l’hydrazide maléique et oligomères fonctionnalisés aldéhyde de PNIPAM ou POEGMA avec moléculaire poids inférieur à la limite de la filtration rénale. Plus précisément, les méthodes pour fabriquer thermoresponsive dégradables en vrac hydrogels (en utilisant une technique de seringue double barillet), particules d’hydrogel (sur les deux la micro-échelle grâce à l’utilisation d’une plate-forme microfluidique facilitant le mélange simultané et émulsion de polymères précurseur et l’échelle nanométrique par l’utilisation d’un moteur thermique auto-assemblage et réticulation méthode), et nanofibres hydrogel (en utilisant une stratégie réactive électrofilage) sont décrites. Dans chaque cas, hydrogels avec température sensibles aux propriétés similaires à ceux obtenus par l’intermédiaire radicalaire classique processus de réticulation est possible, mais le réseau réticulé hydrazone peut se dégrader au fil du temps pour re-former les oligomères polymères de précurseur et la clairance de l’activer. Par conséquent, nous prévoyons que ces méthodes (qui peut être générique appliquée à tout synthétique polymère soluble dans l’eau, smart non seulement des matériaux) permettront de traduction plus facile des matériaux intelligents synthétiques aux applications cliniques.

Introduction

Les matériaux intelligents ont attiré beaucoup d’attention en raison de leur potentiel de réversibles « on-demand » réponses aux signaux externes et/ou environnementaux. Des matériaux sensibles aux températures ont suscité un intérêt particulier en raison de leur comportement inférieure de température (LCST) critique de la solution, résultant dans les précipitations axée sur la température à une température T > LCST¹^,². Dans le contexte des hydrogels thermoresponsive, ce problème de température critique de la solution inférieur se manifeste par réversibles gonflement/désactiver-swelling événements qui donnent lieu à des tailles de température accordable en vrac (plus grosses au T < LCST)³, la taille des pores (plus grande à T < LCST)⁴et propriétés interfaciales (plus hydrophile à T < LCST)⁵. Ces transitions ont été largement appliquées dans l’administration de médicaments (médicament externe ou pour l’environnement-triggerable version⁴^,⁶^,,⁷), tissus techniques et la culture cellulaire (pour adhésion cellulaire THERMORÉVERSIBLE / délamination⁸^,⁹^,¹⁰), cessations d’emploi (pour les porosités de la membrane commutable et perméabilités ou prise en charge diagnostique thermiquement recyclables¹¹^,¹²^, ( ¹³), traite de microfluidique (pour les robinets d’arrêt régulation débit¹⁴^,,¹⁵) et les modificateurs rhéologiques (pour température accordable viscosités¹⁶). Les plus couramment étudiées thermoresponsive hydrogels sont basés sur poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)¹⁷, bien que le travail important (et croissant) ont également porté sur poly (méthacrylate de glycol d’oligoéthylène) (POEGMA)² ^,¹⁸ et poly(vinylcaprolactam) (PVCL)¹⁹^,²⁰. POEGMA a attiré un intérêt récent particulier compte tenu de sa biocompatibilité amélioration prévue²¹^,²²et son comportement LCST de facile-à-tune, dans lesquelles les mélanges linéairement prévisible des monomères avec différents nombres de unités de répétition de l’oxyde d’éthylène dans leurs chaînes latérales peuvent altérer la LCST de ~ 20 ° C à > 90 ° C²^,²³. Cependant, chacun de ces polymères est préparé par polymérisation radicalaire et contient donc une épine dorsale de carbone-carbone, limitant considérablement l’utilité potentielle et la traduisibilité de tels polymères dans le cadre d’applications biomédicales dans lequel dégradation (ou au moins la capacité pour les formalités de filtration rénale) y a une exigence.

En réponse à cette limitation, nous avons rapporté récemment largement sur l’application de la chimie de l’hydrazone (i.e., la réaction entre l’hydrazide maléique et aldéhyde-functionalized des prépolymères) pour préparer dégradables analogues de thermoresponsive hydrogels²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Permet à la réaction rapide et réversible entre groupes hydrazide maléique et aldéhyde sur le mélange des polymères fonctionnalisés précurseur³⁰ fois gelation in situ (permettant l’injection facile de ces matériaux sans besoin de chirurgie implantation ou n’importe quel type de stimulus de polymérisation externe comme initiation de chimiques ou irradiation UV) ainsi que la dégradation hydrolytique du réseau à une vitesse contrôlée par la chimie et de la densité des sites de réticulation. Par ailleurs, en maintenant le poids moléculaire des des prépolymères utilisés pour préparer les hydrogels inférieures à la limite de la filtration rénale, hydrogels, faites à l’aide de cette approche se dégrader dans les polymères d’oligomères précurseur qui peuvent être éliminés de l’organisme²⁵ ^,²⁷^,²⁸. Associée à la faible cytotoxicité et réponse faible tissu inflammatoire induite par ces matériaux²⁵^,²⁶^,²⁷, cette approche offre une méthode potentiellement traduisible pour l’utilisation de thermoresponsive hydrogels intelligentes en médecine, en particulier si bien contrôlées dégradables analogues de ces hydrogels sur toutes les échelles de longueur (en vrac, micro et nano) peuvent être fabriquées.

Dans ce protocole, nous décrivons les procédés de fabrication synthétique thermoresponsive pré polymères fonctionnalisés avec des numéros contrôlés de l’hydrazide maléique et les groupes aldéhyde ainsi que méthodes pour appliquer ces polymères pour créer des hydrogels de dimensions bien définies sur différentes échelles de longueur. En particulier, ce manuscrit décrit quatre approches distinctes nous ont mis au point pour contrôler le mélange de l’hydrazide maléique réactive et aldéhyde-functionalized des prépolymères et créer ainsi des thermoresponsive hydrogel réseaux avec des géométries bien définis et morphologies :

Pour créer les hydrogels biodégradables en vrac avec des tailles définies, une stratégie de création de modèles est décrite par lequel les prépolymères réactives sont chargés dans des barriques séparées d’une seringue double barillet équipé à sa sortie d’un mélangeur statique et par la suite coextrudé en un Moule silicone avec l’hydrogel désiré forme et dimensions²¹^,²⁷ (Figure 1).

Figure 1 : Schéma de formation hydrogel en vrac. Hydrazide maléique et solutions de polymères fonctionnalisés aldéhyde (dans l’eau ou un tampon aqueux) sont chargées dans des barriques séparées d’une seringue double barillet et puis coextrudé grâce à un mélangeur statique dans un moule silicone cylindrique. Rapide in situ gélification sur mélange de formes un hydrazone réticulé hydrogel, qui est autoportante (une fois que le moule est retiré) quelques secondes à minutes selon la densité de concentration et groupe fonctionnel des polymères précurseur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour créer des particules de gel dégradable sur l’échelle de micron, on décrit une méthode de microfluidique réactive dans laquelle précurseur des solutions de polymère sont simultanément mélangées et émulsion à l’aide d’une conception de puce microfluidique Lithographie-basé sur des modèles souples, permettant la formation de gouttelettes de polymères réactifs mixtes gel qui par la suite in situ à microparticules gel forme avec tailles basé sur un modèle de l’émulsion (Figure 2)³¹^,³².

Figure 2 : Schéma de formation de microparticules de gel via microfluidics réactive. (A, B) Hydrazide maléique et solutions de polymères fonctionnalisés aldéhyde (dans l’eau ou un tampon aqueux) sont alimentées par pousse-seringue dans des réservoirs distincts qui sont connectés en aval à travers une série de zig-zag de canaux conçu pour créer un gradient de pression empêchant le refoulement. Les polymères sont ensuite mélangés juste avant d’être cisaillés par huile de paraffine qui coule des deux côtés (également entraînées par une pompe à seringue) et forcées à travers une buse, aboutissant à la production de flux de mise au point de l’humeur aqueuse gouttelettes (solution de polymère) dans une phase d’huile de paraffine continue (voir (B) pour une illustration de la zone de la buse et le processus de formation de gouttelettes). Un deux entrées supplémentaires de huile de paraffine sont placées après la buse à supplémentaire séparé les gouttelettes en suspension dans le canal de collecte permettant de gélification complète avant le retrait de la particule de flux laminaire, après quoi la résultante microparticulaire gelées sont recueilli dans un bécher magnétiquement agité ; Photo (C) du processus de génération de gouttelettes à la buse (Notez que le polymère hydrazide maléique est étiqueté comme bleu pour illustrer le mélange)

Pour créer le gel dégradable des particules à l’échelle nanométrique, un moteur thermique réactive l’auto-assemblage est décrit la méthode dans laquelle une solution de l’un des polymères réactives précurseur (le polymère « graine ») est chauffée au-dessus de la LCST pour former un nanoaggregate stable qui est par la suite réticulé par l’addition du polymère précurseur réactifs complémentaires (polymère « réticulation ») ; le nanogel de RETICULE hydrazone qui en résulte a une taille basé sur un modèle directement par la nanoaggregate (Figure 3)²⁸.

Figure 3 : Schéma de formation nanogel via pilotée par thermiquement réactive auto-assemblage. Une solution aqueuse contenant le polymère d’hydrazide maléique fonctionnalisés (thermoresponsive) est chauffée au-dessus de sa température critique de la solution plus bas pour créer un nanoaggregate non stable. Suite, un polymère fonctionnalisés aldéhyde est ajouté au crosslink la nanoaggregate via la formation d’une liaison hydrazone et ainsi stabiliser la particule nanogel lors du refroidissement au-dessous de la LCST. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour créer des nanofibres dégradables, décrit une technique réactive électrofilage dans lequel une seringue double barillet équipée d’un mélangeur statique à sa sortie (comme utilisé pour la fabrication des hydrogels en vrac) est attachée à une plateforme standard électrofilage (Figure 4 )³³.

Figure 4 : Schéma de formation de nanofibres hydrogel par électrofilage réactive. Une seringue double barillet avec un mélangeur statique (chargé comme pour le vrac hydrogels, mais incluant aussi une fraction de poids moléculaire élevé poly(ethylene oxide) comme aide électrofilage) est montée sur une pompe à seringue avec l’aiguille à l’extrémité de la seringue connectée pour une alimentation à haute tension. Hydrazone réticulation se produit au cours de la fibre, processus de filature afin que quand le flux frappe le collecteur (feuille d’aluminium ou un disque en aluminium) la morphologie nanofibrous est maintenue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’application de ces méthodes pour la création de réseaux dégradable hydrogel smart est démontrée dans ce protocole utilisant PNIPAM ou POEGMA comme le polymère d’intérêt ; Toutefois, les approches de base décrits peuvent être traduits à un polymère soluble dans l’eau, mais avec des ajustements appropriés pour la viscosité et (dans le cas de l’auto-assemblage nanogel de procédé de fabrication) la stabilité du polymère avant dans la formation de la graine nanoaggregate.

Protocol

1. synthèse de polymères fonctionnalisés Hydrazide maléique Note : La recette spécifique suivante est dotée pour le polymère de précurseur de PNIPAM-mimetic thermoresponsive POEGMA (PO10) fonctionnalisation de hydrazide maléique 30 mol %. Polymères de précurseur PNIPAM et POEGMA avec des températures de transition de phase différente peuvent être préparées en utilisant cette même méthode générale mais en modifiant le type et le rapport entre les monomères de base utilisées (voir section 1.2 modifications pour divers polymères POEGMA)21 , 25 , 27. Peser, 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, initiateur), 3,1 g de méthacrylate de diéthylène glycol (M(EO)2MA), 0,9 g de diiodures méthacrylate (OEGMA475, 475 g/mol n = unités répétées d’oxyde d’éthylène de 7-8), 523 µL de acide acrylique (AA, comonomère) et 7,5 µL d’acide thiolglycolic (TGA, agent de transfert de chaîne) dans un flacon de scintillation de verre de 20 mL. Pour PO0 (température de transition de température ambiante POEGMA), utilisez 4,0 g de M(EO)2MA (aucun OEGMA475). Pour PO100 (aucune température de transition POEGMA), utilisez 4,0 g de OEGMA475 (non M(EO)2MA).Remarque : Phase intermédiaire des températures de transition est possible basée sur l’utilisation de mélanges intermédiaires de M(EO)2MA et OEGMA475, selon Lutz et al. 23 Dissoudre tous les réactifs dans le dioxane (monomère total 5 mL/g) dans un ballon à fond rond avec un ou plusieurs cols. Purger la réaction avec le courant d’azote (grade UHP) pendant 30 min. Une fois purgés, placer le ballon dans un bain d’huile préchauffée maintenu à 75 ° C pendant 4 h sous azote et agitateur magnétique 400 tr/min. Après 4 h, enlever le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif réglé sur 50 ° C et 200 tr/min. Dissoudre le produit polymère résultant dans 150 mL d’eau désionisée. Ajouter dihydrizide acide adipique (ADH) à un excès molaire multiplié par cinq le nombre de résidus de AA incorporé dans le polymère (dans cet exemple, AA comprend 29 mol % des unités de monomère dans les polymères produites, selon titrage conductimétrique). Ajuster le pH de la solution à pH 4,75 avec 0,1 M HCl. Une fois que le pH est stabilisé, ajouter N-(3-dimethylaminopropyl) -N’-ethylcarbodiimide (EDC) à un excès molaire 5 fois le nombre de résidus de AA présents). Maintenir le pH de la réaction 4,75 avec ajout de goutte à goutte de 0,1 M HCl sur une période de 4 h. Laissez la réaction de remuer pendant la nuit. Verser la solution dans trois tubes de dialyse longue ~ 30 cm (3500 Da poids moléculaire limite, 1 pouce d’épaisseur), en utilisant un entonnoir pour minimiser les fuites. Utilisez une pince pour fermer le fond du tube avant le remplissage en repliant un segment de petite taille (environ 2 cm) du tube pour améliorer l’intégrité de la pince ; répéter en haut (en appuyant pour enlever les bulles d’air) lorsque le remplissage est terminé. Placer les tubes à l’intérieur d’un volume 100 fois d’excès d’eau désionisée et laisser pendant au moins 6 h, totalement remplacer l’eau plus de six cycles de dialyse pour atteindre la pureté désirée. Lyophiliser l’échantillon dialysée afin d’obtenir un produit final polymère séchées. 2. synthèse des polymères fonctionnalisés aldéhyde Synthèse d’aldéhyde-précurseur monomère méthacrylate de N-(2,2-Dimethoxyethyl) (DMEMA) Place 200 mL d’une solution de NaOH 20 % p/v dans un ballon à fond rond 500 mL 3 col. Laisser refroidir la solution dans un bain de glace et maintenir une température de 0 ° C avec de la glace au cours de la réaction. Ajouter 50 mL d’aminoacetyl diméthylacétal d’aldéhyde dans la solution de NaOH refroidie. Ajouter 0,1 g de TEMPO ((2,2,6,6-tétra-tétraméthylpipéridine-1-yl) oxyl) et remuer à 400 tr/min en utilisant une barre magnétique remuer jusqu’à ce que le TEMPO se dissout entièrement. Ajouter 48 mL de chlorure de methacryloyl goutte à goutte à l’aide d’une burette de plus de 2 h. Après 2 h, couvrir la cuve de réaction avec le papier d’aluminium et laisser remuer toute la nuit. Extraire le produit en ajoutant le produit de la réaction à 75 mL d’éther de pétrole dans une ampoule à décanter 1 L, secouant, dégazage et en jetant la couche supérieure. Répétez l’étape 2.1.7 trois fois en ajoutant le produit de couche de fond de chaque étape de l’extraction que le produit brut pour le prochain cycle d’extraction. Retirer le produit de couche de fond définitif et le transfert dans un bécher de 100 mL. Ajouter environ 5 g de sulfate de magnésium (Mg2SO4) bécher monomère jusqu’à une « boule à neige » effet est observé. Filtrer à travers un 100 mL entonnoir Buchner pour enlever le Mg2SO4. Rincer le becher deux fois avec environ 75 mL de tert-butyl éther méthylique, verser la solution de rinçage dans l’entonnoir chaque fois. Transférer le produit dans un ballon à fond rond 500 mL et laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à température ambiante 200 tr/min pour recueillir le produit final. Synthèse de polymères fonctionnalisés aldéhydeRemarque : La recette suivante spécifique est prévue le polymère précurseur de PNIPAM-mimetic POEGMA (PO10) avec 30 fonctionnalisation d’aldéhyde mol %. Polymères de précurseur PNIPAM et POEGMA avec des températures de transition de phase différente peuvent être préparées en utilisant la même méthode mais en modifiant le type et le rapport entre les monomères de base utilisées (voir section 1.2 modifications pour divers polymères POEGMA)21 , 25 , 27. Peser, 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3,10 g de diéthylène glycol méthacrylate M(EO)2MA, 0,1 g de méthacrylate d’éthylèneglycol oligo (OEGMA475, 475 g/mol, n = unités répétées d’oxyde d’éthylène de 7-8), 1,30 g de N-(2, 2- dimethoxyethyl) acrylamide (DMEMA) et 7,5 µL d’acide thiolglycolic (TGA) dans un flacon de scintillation de verre de 20 mL. Pour PO0 (température de transition de température ambiante POEGMA), utilisez 4,0 g de M(EO)2MA (aucun OEGMA475). Pour PO100 (aucune température de transition POEGMA), utilisez 4,0 g de OEGMA475 (non M(EO)2MA).Remarque : Phase intermédiaire des températures de transition est possible basée sur l’utilisation de mélanges intermédiaires de M(EO)2MA et OEGMA475, selon Lutz et al. 23 Dissoudre tous les réactifs dans le dioxane (monomère total 5 mL/g) dans un ballon à fond rond avec un ou plusieurs cols. Purger la réaction avec le courant d’azote (grade UHP) pendant 30 min. Une fois purgés, lieu de ballon dans un bain d’huile préchauffée maintenue à 75 ° C pendant 4 h sous azote et agitateur magnétique 400 tr/min. Après 4 h, enlever le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif réglé sur 50 ° C et 200 tr/min. Dissoudre le produit résultant du polymère dans 100 mL de désionisée H2O. Ajouter 50 mL de 1 HCl de M dans la solution dissoute et remuer en vertu de l’agitateur magnétique (400 tr/min) pendant 24 h à hydrolyser complètement les fonctionnalités de l’acétal dans DMEMA. Après la fin de la réaction, transvaser la solution de polymère dans tube à dialyse, comme par l’Etape 1.13. Lyophiliser l’échantillon dialysée afin d’obtenir un produit final polymère séchées. 3. fabrication d’Hydrazone réticulé en vrac Hydrogels Dissoudre l’hydrazide maléique et polymères fonctionnalisé d’aldéhyde séparément dans une solution saline tamponnée au phosphate de 10 mM (PBS) ou n’importe quel tampon aqueux désiré, pour créer des solutions de concentrations souhaitées.Remarque : Les concentrations de masse entre 5 et 40 % en poids sont généralement utilisées, avec gélification à des concentrations plus faibles possibles si les fractions de groupe fonctionnel supérieures sont présentes sur les polymères. En utilisant une seringue unique pour les solutions de transfert, chargez chaque solution précurseur (~ 1 mL chacune) dans des barriques séparées d’une seringue double barillet (volume de 2,5 mL, seringue de ratio 1:1) attachée à un mélangeur statique (longueur 1,5″) et (éventuellement) une seringue (en général 18 G, longueur 1.5″ pour des études in vitro) et (éventuellement) une seringue (en général 18 G, 1.5″ longueur des études in vitro). Préparer les moules de l’épaisseur désirée, la forme et de diamètre de poinçonnage de trous dans une feuille de caoutchouc de silicone.Remarque : Dans une expérience typique, un ensemble de poinçon standard est utilisé pour percer un trou cylindrique de diamètre 7 mm à l’intérieur d’un 1/16″ épaisseur de silicone feuille de caoutchouc (volume total de réservoir ~ 300 µL). Mont le moule silicone sur un microscope standard verre glisser telle que les trous poinçonnés dans le moule sont totalement soutenus par verre. Un lavage de HCl 0,1 M du verre est recommandé mais pas obligatoire avant le montage du Moule silicone. Extruder conjointement le contenu du seringue double barillet par le mélangeur statique pour remplir complètement (ou un peu trop remplir, avec un ménisque en haut) le moule silicone.Remarque : Plusieurs échantillons peuvent être préparés au cours de l’échantillon d’une extrusion pourvu que le temps de gélification est du même ordre de grandeur ou plus longtemps que le temps total nécessaire pour remplir les moules multiples. Placez une autre lame de microscope standard verre sur le dessus du moule et attendre la gélification terminer.Remarque : Les recettes standards décrits dans le gel de l’article de synthèse dans < 1 minute ; temps de gélification plus lentes (et donc plus longs temps d’attente requis) sont observées au groupe fonctionnel des densités plus faibles, des concentrations plus faibles de polymère et/ou fractions supérieures de OEGMA475 par rapport à M(EO)2MA (pour POEGMA hydrogels). Retirez la lame de microscope haut de la page et utilisez une spatule pour pousser l’hydrogel loin le moule en caoutchouc de silicone. Soulever le moule de basse lame de microscope pour récupérer les hydrogels pour des tests supplémentaires. 4. fabrication de microparticules de Gel réticulé Hydrazone Fabrication de puce microfluidique Déshydrater une plaquette de silicium (D = 76,2 mm, 380 µm d’épaisseur, dopée P, orientation) en chauffant le tout sur une plaque de cuisson à 200 ° C pendant 5 min. Centrez la plaquette sur une coucheuse spin et manteau de résister à une couche épaisse de ~ 100 µm de photorésine SU-8 100 en appliquant ~ 7 mL de SU-8, rampe le spin speed jusqu’à 3000 t/mn à raison de 500 tr/min/s et puis à la tenue de la vitesse à 3000 tr/min pendant 30 secondes. Pré cuire le revêtement à 65 ° C pendant 10 min et puis mou-cuire le revêtement à 95 ° C pendant 30 min. Imprimer un photomasque sur un transparent avec le modèle de microfluidique défini par la Figure 2A, tels que les sections transparentes sont le motif désiré de la couche de résine photosensible polymérisé. Insérer la plaquette de silicium enduit de résine photosensible et le photomasque dans un aligneur de masque et exposer la gaufrette à la lumière 365 nm pour 95 s (puissance de l’exposition de 6,5 W). Faites cuire la gaufrette modelée pendant 10 min à 95 ° C, tout d’abord en le plaçant sur une plaque chauffante à 65 ° C et ensuite chauffer la plaque de cuisson à 95 ° C à 10 ° C/min. Enlever la plaquette de la plaque chauffante et la placer dans un bécher de 500 mL contenant développeur 100 mL SU-8 pendant au moins 10 min, agitant la gaufrette lentement dans la solution tout au long d’enlever la résine photosensible non exposée. Après 10 min, rincer la gaufrette modelée avec de l’isopropanol et sécher à l’air. Stocker la gaufrette à motifs dans un environnement frais et sec, loin de la lumière quand pas en service pour le bâti de réplique de lithographie douce. Placer le moule de la microfluidique à motifs dans une boîte de Pétri. Poste ~ 10 mm longueurs de tuyau silicone 13 L/S sur les entrées et sorties de la puce. Verser environ 10 mL de poly (siloxane diméthylique) (PDMS ; préparé en mélangeant Base d’élastomère de Silicone et Agent de durcissement élastomère Silicone dans un rapport de 10:1) sur le dessus de la puce, évitant soigneusement incorporant tout PDMS dans le tube en silicone placé. Placer la boîte de Pétri dans une chambre à vide pendant environ 10 min enlever les bulles d’air persistant dans et autour de la structure à motifs pendant le durcissement. Guérir le PDMS en plaçant la boîte de Pétri contenant le moule à motifs et non polymérisée PDMS sur une plaque de cuisson à 85 ° C pendant 2-3 h. Décoller soigneusement le PDMS durci de la plaquette de silicium à motifs pour exposer la réplique PDMS douce motifs lithographique du moule microfluidiques. Place le PDMS à motifs et une lame de verre à l’envers dans un plasma de haute puissance avec une alimentation en air. Appliquer le plasma à 200 mTorr et 45 W pour 90 s pour coller le PDMS à la lame de verre et de créer la puce microfluidique final. Synthèse de microparticules de Gel Préparer le PNIPAM fonctionnalisés hydrazide maléique (PNIPAM-Hzd) en dissolvant NIPAM (4,5 g), acide acrylique (0,5 g – 15 monomère total de mol %), acide thioglycolique (TGA, 80 µL) et 2, 2-azobisisobutyric acide diméthyl ester (AIBME, 0,056 g) dans 20 mL d’éthanol anhydre et par la suite suivant étapes 1.4-1.14 pour compléter la synthèse, bien que le changement de la température de réaction à 56 ° C à l’étape 1.5. Préparer le PNIPAM aldéhyde fonctionnalisés (PNIPAM-Ald) en dissolvant NIPAM (4 g), N-(2, 2-dimethoxyethyl) méthacrylate (DMEMA, 0,95 g – 13,4 monomère total de mol %), acide thioglycolique (TGA, 80 µL) et 2, 2-azobisisobutyric acid diméthyle (AIBME, 0,056 g) dans 20 mL d’éthanol et par la suite suivant étapes 2.2.4-2.2.10 pour compléter la synthèse, bien que le changement de la température de réaction à 56 ° C à l’étape 2.2.5. Dissoudre le PNIPAM-Hzd et Ald PNIPAM à 6 % en poids dans l’eau désionisée et charge dans séparé standard mL 5 seringues. Dissoudre 1 wt % surfactif (p. ex., Span 80) dans de l’huile de paraffine lourde et chargez la solution dans une seringue standard 60 mL. Connectez les deux précurseurs polymères solution seringues individuellement pour les deux canaux d’entrée distinct polymère sur la puce microfluidique et la solution d’huile de paraffine pour le canal d’admission de l’huile sur la puce microfluidique via 1/32″ ID tuyau silicone (~ 30 cm de longueur par sortie, ~ 45 cm de longueur par point de vente). En utilisant deux séparer les pompes à perfusion seringue (un pour l’huile en amont, pour l’huile sont complété par la buse), remettre de l’huile dans la puce à un débit de 1,1 mL/h 5,5 mL/h sans démarrer le flux de polymère pour amorcer la puce et de s’assurer que la puce est sans défaut et opérationnel (généralement maintenue sur une période de 30 min). À l’aide d’une seringue de perfusion séparée, chacune des solutions aqueuses de polymère offrent à la puce à un débit de 0,03 mL/h. Après une période initiale de stabilisation, pour que le flux a équilibrée et particules uniformes sont formées (30 min – 1 h), collecter les particules dans un ballon à fond rond agité magnétiquement. Recueillir les particules jusqu’à ce que toute l’huile est consommée (55-12 h, selon le débit). Arrêt des pompes de seringue et, si vous le souhaitez, immédiatement pomper de l’eau à la place les solutions de polymère précurseur grâce à la puce pour nettoyer. Toutefois, compte tenu de la gélification rapide in situe de ces matériaux lorsque la circulation est arrêtée, il est recommandé d’utiliser une nouvelle puce pour chaque expérience distincte. Désactiver l’agitateur magnétique et laisser les microparticules de gel à régler. Décanter hors toute huile de paraffine disponible à l’aide d’une pipette. Pour enlever l’huile de paraffine restante, laver les microparticules de gel avec du pentane (appliqué à un volume de 10 mL pour chaque 0,5 mL de volume au moyen de microparticules), Mélanger vigoureusement l’émulsion pour ~ 1 minute, laisser les microparticules de gel à re-régler pour ~ 1-2 heures et décanter hors la phase organique résiduelle à l’aide d’une pipette. Répéter au moins 5 fois pour garantir l’élimination de huile de paraffine complet. Purge le flacon avec de l’azote durant la nuit pour enlever tout résidu pentane et remettre en suspension les microparticules de gel dans 10 mL d’eau désionisée à l’intérieur d’un flacon de scintillation de verre de 20 mL. 5. fabrication d’Hydrazone réticulé Nanogels Dissoudre les solutions mères de PNIPAM-Hzd (1 w/v%) et PNIPAM-Ald (1 w/v%) dans l’eau désionisée. Préparer le PNIPAM-Hzd et Ald PNIPAM comme indiqué aux points 4.2.1 et 4.2.2, respectivement. Faire chauffer une portion de 5 mL de la solution mère de PNIPAM-Hzd à 70 ° c à l’aide d’un bain d’huile en vertu de l’agitateur magnétique (350 tr/min) à l’intérieur d’un flacon de scintillation de verre de 20 mL.Remarque : La solution devienne opaque (c’est-à-dire la température est supérieure à la température plus basse de la critique de la solution du PNIPAM-Hzd), mais aucun précipité visible ne doit être formée. Ajouter une portion de 0,25 mL de PNIPAM-Ald (5-20 % en poids de la masse du PNIPAM-Hzd présents dans la solution de la graine) goutte-à-goutte dans la solution de PNIPAM-Hzd chauffée sur une période de 5 à 10 s. Continuer à mélanger que la solution dans la scintillation fioles pour 15 minutes supplémentaires, après qui enlèvent l’échantillon provenant du bain d’huile et laissez le produit refroidir à température ambiante pendant la nuit. Dialyser le nanogels qui en résulte au fil des cycles de 6 x 6 heures (à l’aide d’une membrane de dialyse 3500 kDa MWCO) contre l’eau déionisée pour enlever tout polymère non réticulé. Si vous le souhaitez, lyophiliser pour le stockage. 6. fabrication de nanofibres réticulé Hydrazone Préparer POEGMA fonctionnalisés hydrazide maléique (POEGMA-Hzd) en dissolvant mg 37 diméthyl 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), méthacrylate diiodures 4,0 g (OEGMA475, 475 g/mol, n = unités répétées d’oxyde d’éthylène de 7-8) et acide acrylique 0,25 g (AA) dans le dioxane 20 mL et en suivant les étapes 1.3-1.14 pour compléter la synthèse. Préparer fonctionnalisés aldéhyde POEGMA (POEGMA-Ald) en dissolvant 50 mg diméthyl 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), méthacrylate diiodures 4,0 g (OEGMA475, 475 g/mol, n = unités répétées d’oxyde d’éthylène de 7-8) et 0,60 g N-(2, 2- méthacrylate de dimethoxyethyl) (DMEMA) dans le dioxane de 20 mL et suivant étapes 2.2.3-2.2.10 pour compléter la synthèse. Dissoudre POEGMA-Hzd (15 % en poids) et POEGMA-Ald (15 % en poids) dans les solutions de l’eau désionisée séparée. Dissoudre le poly (oxyde d’éthylène) (PEO, M,w= 600 x 103 g/mol, 5 % en poids) dans l’eau désionisée. Mélanger 1 mL de solution avec chaque solution POEGMA réactive préparée à l’étape 6.3 pour créer des solutions de dernier précurseur de 7,5 wt % POEGMA précurseur de polymère et de 2,5 % en poids PEO PEO. Charger les deux solutions dans des barriques séparées de la même seringue double barillet visées à l’article 3 (y compris le mélangeur statique 1.5″) et monter la seringue double barillet sur une pompe à seringue perfusion. Attacher un mélangeur statique et une aiguille 18G de pointe arrondie à la seringue double barillet. Connecter une alimentation haute tension à l’aiguille pointe blunt, s’est échoué sur le collecteur.NOTE : Collecteurs sont constitués soit d’un carré de 10 x 10 mm de papier d’aluminium ou un disque d’aluminium diamètre de ~ 10 mm tournant à une vitesse de 200 tr/min, tous les deux monté perpendiculairement à l’aiguille à une distance de 10 cm de l’extrémité de l’aiguille. Démarrer la pompe seringue à raison de 0,48 mL/h et, simultanément, mettre en marche une haute tension de 8,5 kV pour exécuter l’électrofilage et créer des nanofibres. Continuer électrofilage comme vous le souhaitez faire des échafaudages de différentes épaisseurs, ou jusqu’à ce que les solutions d’entrée sont épuisées. Pour supprimer l’aide d’électrofilage PEO, tremper les échafaudages recueillies pendant 24 h dans l’eau désionisée.

Representative Results

En vrac hydrogels expulsées, une seringue double dans un moule de silicone sont conformes aux dimensions du moule et devenir autonome lors du retrait du moule ; gélification se produit généralement secondes ou minutes suivant la coextrusion selon précurseurs polymères utilisée. La caractérisation typique par l’intermédiaire de gonflement (mesurée par méthode gravimétrique à l’aide d’un insert de culture cellulaire pour retirer facilement l’hydrogel la solution gonflement), thermoresponsivity (mesuré en utilisant la même technique mais le cyclisme à la température d’incubation ci-dessus et la température de transition de phase), dégradation (mesurée en utilisant la même technique mais plus longues périodes de temps) et au cisaillement ou module de compression (mesurée à l’aide d’échantillons de 2 mm d’épaisseur et 7 mm de diamètre moulé) illustre l’accordabilité de l’hydrogel réponses en fonction de la composition chimique du polymère précurseur (plus précisément, pour POEGMA, le ratio de court aux monomères OEGMA longue chaîne utilisées pour préparer l’hydrogel), la fraction molaire de groupes fonctionnels sur les polymères de précurseur et la concentration de ceux précurseurs polymères (Figure 5)27. Microfluidique conduit à la formation de microparticules de gel bien définis à l’échelle de la taille de 25 à 100 µm, avec la taille contrôlable, fondée sur les taux d’écoulement de l’huile et/ou les polymères aqueux combiné phases (Figure 6 a)31. Microscopie optique chaude scène confirme que les microparticules de gel de maintiennent la nature thermoresponsive des hydrogels en vrac, montrant réversible dépend de la température gonflement-deswelling avec seulement une légère hystérésis sur cycle 1 (attribuables à la formation d’irréversibles liaison hydrogène entre les groupes amide voisins dans l’ État réduit34) conforme à celui observé en vrac PNIPAM hydrogels (Figure 6 b)32. En outre, les microparticules de gel dégradent vers leurs oligomères précurseurs au fil du temps, permettant à32de la clairance rénale (Figure 6). Auto-assemblage pilotée par la nanoaggregation d’un polymère PNIPAM fonctionnalisés hydrazide maléique dans une solution chauffée suivi par réticulation avec un aldéhyde fonctionnalisés PNIPAM polymère entraîne très monodispersés nanogels (polydispersité < 0,1) sur la variant de 180 à 300 nm, en fonction des conditions de processus utilisés (Figure 7A)28. Les nanogels conservent le comportement typique thermoresponsive de nanogels PNIPAM réticulé de radicaux libres classiques, avec des degrés inférieurs de deswelling thermique observé que plus la réticulation de polymères a été ajouté (Figure 7B). Le nanogels peut être lyophilisée et redispersed sans un changement de la taille des particules (Figure 7C) et se dégrade au fil du temps par hydrolyse pour re-former les polymères d’oligomères précurseur utilisés pour formuler le nanogels (Figure 7D). Électrofilage réactive crée un nanofibrous structure de l’hydrogel (Figure 8A), avec des diamètres de nanofibres sur l’ordre de ~ 300 nm réalisable sans particules visibles electrosprayed présentent33. Tremper les nanofibres axée sur les POEGMA dans l’eau se traduit par hydratation rapide (environ deux ordres de grandeur plus rapides que celui obtenu avec un gel en vrac de même composition, Figure 8B), mais maintient la morphologie nanofibrous pendant 8-10 semaines avant dégradation hydrolytique dans des conditions physiologiques ; dégradation plus rapide est observée dans les environnements catalysée par un acide, comme prévu en raison du risque de dégradation de liaison hydrazone acido-catalysée (Figure 8-C). Les structures nanofibrous sont également mécaniquement robustes à l’état sec et gonflées sur plusieurs cycles, ce qui permet une manipulation facile et répétitives serrage (Figure 8D). Figure 5 : Propriétés de in situ -gélifiant en vrac hydrogels biodégradables thermoresponsive. (A) représentant POEGMA gel microstructures réseau et images hydrogel en vrac avec des temps de gélification correspondants en fonction de l’incorporation de % de mole de OEGMA475 dans les polymères de précurseur ; (B-C) Module de stockage d’hydrogels100 PO par différentes concentration de polymère précurseur (B) et (C) mole % groupe fonctionnel incorporation par polymère précurseur ; (D-F) Propriétés physico-chimiques des hydrogels POEGMA en fonction du % d’incorporation OEGMA475 mole : profil de dégradation module (E) (D) stockage en 1 M HCl et température de transition phase volume (F) en réponse à température changer avec la gamme 20-60 ° C. Toutes les barres d’erreur représentent l’écart-type de n = 4 mesures répétées. Adapté de référence27 avec la permission de Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Propriétés de microparticules de gel dégradables de réactif microfluidics. (A) l’effet du débit d’huile paraffine gel (purifié) taille de microparticules dans l’eau ; (B) Thermoresponsivity de microparticules de gel purifié dans l’eau après un seul cycle thermique au-dessus et au-dessous de la température de transition de phase de volume ; Visual c évaluation (photos) et traces de chromatographie sur gel de perméation (graphique) confirmant la dégradation de microparticules de gel de retour à leurs composants de polymère précurseur (ici, en 1 M HCl pour faciliter la dégradation accélérée sur l’échelle de temps de l’imagerie) ; Echelle = 100 µm. adapté de référence32. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Propriétés des nanogels dégradables de réactif auto-assemblage. (A) distributions granulométriques de nanogels préparé avec les rapports de masse polymère aldéhyde : hydrazide maléique différents de diffusion dynamique de la lumière (en médaillon : confirmant la nature sphérique de la nanogels au microscope électronique) ; (B) thermosensibilité de particules auto-assemblés en fonction du ratio masse entre polymère aldéhyde : hydrazide maléique utilisé pour préparer le nanogels (à partir de diffusion dynamique de la lumière), avec des barres d’erreur qui représente l’écart type de n = 4 répétitions ; Confirmation de Visual (C) de l’absence d’agrégation nanogel avant et après lyophilisation ; D confirmation visuelle de la dégradation acido-catalysée des nanogels (ici en 1 M HCl, par souci de cohérence avec d’autres études ci-dessus) ; E gel perméation chromatographe traces de produits de dégradation nanogel indiquant leur similarité avec l’hydrazide maléique et polymères fonctionnalisés aldéhyde précurseur. Adapté avec la permission de référence28. Copyright 2015, American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Propriétés de nanofibres dégradables de réactif électrofilage. (A) microscopie électronique d’État (à gauche), moitié plongé dans l’eau (milieu, thin film) images de nanofibres sur le sec et complètement trempés dans l’eau pendant la nuit (échafaudage droite, épaisse) ; (B) gonflement des nanofibrous hydrogel (rouge) par rapport à un hydrogel en vrac (bleu) de la même composition, avec des barres d’erreur qui représente l’écart type de n = 4 répétitions ; (C) analyse les images visuelles microscopie électronique et (en médaillon) suivi de la dégradation acido-catalysée de nanofibres dans 1 M HCl ; (D) cyclisme résistance à la traction de dry (80 cycles de séchage, 20 % allongement/cycle) et gonflées (325 cycles, 10 % allongement/cycle en 10 mM PBS) électrofilées nanofibrous hydrogels. Figure modifié de référence33 et reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous avons appliqué avec succès toutes ces techniques de fabrication à plusieurs systèmes de polymère avec seulement de légères variations des méthodes décrites en détail plus haut pour le PNIPAM et POEGMA ; Toutefois, les utilisateurs de ces protocoles doivent être conscients des problèmes potentiels qui peuvent survenir lorsque les autres polymères sont substitués dans ces processus. En particulier, augmentation de la viscosité des polymères précurseur peut nuire tant la processabilité (surtout dans la méthode de la microfluidique) ainsi que l’efficacité du mélange des polymères deux précurseurs. En outre, le temps de gélification des polymères doivent être contrôlé à un taux qui dépend de la morphologie ciblée afin d’éviter la gélification prématurée qui sert à débit ou à empêcher l’interdiffusion des polymères réactifs avant, essentielles pour former la direction désirée structures de gel homogène. Les limites précises de chaque stratégie, mais aussi des approches, que nous avons utilisé pour adapter ces approches pour traiter ces restrictions à l’échelle de longueur de chaque fabrication, sont décrits ci-dessous.

En vrac les hydrogels par coextrusion de seringue double barillet
Temps de gélification est la variable clé de contrôle afin de garantir l’efficacité de la technique de seringue double barillet pour former des hydrogels en vrac. Polymères qui gel trop vite au contact ( 5 s sont préférables (bien que non obligatoire) pour l’utilisation de cette technique ; Cela est particulièrement important si hydrogels répétées sont cast pour analyses physiques ou mécaniques pour s’assurer que chaque cast hydrogel a la même composition. Temps de gélification peut être facilement modifié en changeant la densité des groupes fonctionnels réactifs sur l’un ou les deux polymères précurseur (densité plus faible groupe fonctionnel conduisant à la gélification plus lente) ou changeant la concentration des polymères précurseurs utilisés pour former le gel ( abaisser la concentration conduisant à la gélification lente)²¹. Alternativement, remplaçant le groupe aldéhyde (plus réactif) avec le groupe cétone (moins réactif) comme électrophile dans la paire gélifiant considérablement réduit le temps de gélification sans modifier sensiblement la composition de l’hydrogel qui en résulte³⁵; préparé des polymères avec des mélanges d’aldéhyde et précurseurs de monomère de cétone peuvent être utilisés pour régler le temps de gélification comme vous le souhaitez sans modifier la concentration de polymères précurseur utilisé (et donc le pourcentage en masse de matières solides dans le gel qui en résulte formé).

Nous aimerions également souligner que la première conversion hydrogel n’a pas toujours les mêmes propriétés que les hydrogels ultérieures cast, une remarque attribuée à légères différences dans la vitesse à laquelle le contenu des deux barils réellement atteindre le mélangeur statique. Ainsi, nous avons généralement amorcer la seringue double barillet en extrudant une petite (< 0,3 mL) fraction du gel avant d’amorcer le processus de coulée pour minimiser cette variabilité. Enfin, bien que pas généralement problématique lors de l’utilisation des oligomères synthétiques prépolymères, la viscosité d’une ou plusieurs solutions de polymère précurseur peut poser un défi dans le contexte de cette technique, qu’il s’agisse de faciliter les flux à l’aide de dépression simple pouce ainsi que la promotion efficace de mélange dans le mélangeur statique. Cependant, étonnamment, même les solutions de polymères précurseur avec nettement différentes viscosités forment encore hydrogels relativement homogènes en utilisant les embouts mélangeur statique décrites dans la liste des pièces (par exemple, PNIPAM avec une haute moléculaire poids de glucides²⁶), ce qui laisse supposer que les préoccupations au sujet de mixage inefficaces à la suite de viscosités mal appariées peut être négligeable au moins sur la balance en vrac. Si nécessaire, l’utilisation d’une pompe à seringue (au lieu du pouce) au flux de commande et/ou de l’utilisation d’une aiguille de calibre plus gros à la sortie peut aider à surmonter les problèmes associés à extrudabilité dans ces systèmes.

Microscale hydrogels via réactive microfluidique
L’étape clé associée à l’approche de la microfluidique pour fabrication de microparticules de gel est l’amorçage de la puce microfluidique avec les deux polymères réactives. Si les polymères sont livrés avec des pressions différentes ou à des taux différents dans la puce, la pression différentielle peut conduire le refoulement de la solution de polymère un précurseur dans le réservoir (ou du moins vers le réservoir) de l’autre polymère précurseur. Cela se traduit par gélification en amont de la formation de particules, bloquant efficacement les flux et donc nécessitant une élimination de puce. Le chemin tortueux imprimé entre chaque réservoir et le point de mélange crée une résistance importante à reflux ; Cependant, même un opérateur qualifié sera gel occasionnellement une puce avant un régime d’écoulement stable est atteint. Selon notre expérience, entre 1-2 min est habituellement requis pour stabiliser le flux suivant le début de la formation de gouttelettes (quel temps relativement polydispersés gel de microparticules sont produits) ; Si aucun problème n’est observés dans les premières 5-10 minutes d’opération, il est probable que plusieurs heures de production de particules monodispersés continu est possible. L’utilisation de précurseurs polymères avec viscosité relativement bien assortie ainsi que temps de gélification non instantanée (au moins > 15 s préférable) aide grandement à éviter ce genre de problèmes et de promouvoir la formation des flux stables.

Remarque que diverses débits allant de 0,01 à 0,1 mL/h dans la phase aqueuse et 1,1 à 5,5 mL/h dans la phase huileuse ont été testés à l’aide de cette conception de la puce, conduisant à la fabrication des particules sur la gamme de taille de ~ 25-100 µm selon le cisaillement appliqué à la débit de mise au point de jonction ; débits plus rapides synonyme de cisaillement plus élevé et donc plus petites particules formées³¹^,³². Faire varier le débit d’huile tout en gardant le total aqueuse débit faible (cités dans le protocole, ~0.03 mL/h) s’est avéré plus efficace pour contrôler la taille de microparticules de gel sans compromettre la monodispersion ou la durée de vie de l’appareil, qui étaient tous deux observé à réduire de manière significative à l’extrémité supérieure des cité débits aqueux total. Plus grand débit d’huile (> 5,5 mL/h) pour créer des particules plus petites sont possibles, mais a augmenté le risque de décollement de puce (limitation des courante rencontrée avec plasma-collé des puces microfluidiques PDMS). Les puces utilisant une autre méthode de liaison peut permettre des débits plus rapides et donc plus petite production de microparticules de gel, une stratégie que nous explorons actuellement. Réduction de la taille de la buse peut également aider à réduire la taille des microparticules qui pourraient être produites, bien qu’à un risque accru de gélification prématurée avant la formation de particules. Débits plus lentes tend à mener à l’écoulement des instabilités et donc polydispersités plus élevées et un risque accru de gélification de la puce ; Cette limitation pourrait être surmontée en utilisant un système de contrôle de flux multicanal microfluidique qui possède une meilleure stabilité et une résolution plus élevée que les pompes à seringue standard utilisés dans le présent protocole.

Le choix de l’huile a été essentiels à la réussite de ce protocole, comme les huiles plus lourds (favorables en termes de prévention gel MICROPARTICULE agglomération après le prélèvement) a conduit à la formation de particules beaucoup moins cohérente au niveau du bec que l’huile de silicone clair rapporté dans le protocole. Nous croyons que cela réduit la reproductibilité est un résultat plus faible cohérence de seringue pompage des huiles lourdes, conduisant à un cisaillement plus variable au point mélange. Évitant le gel au moyen de microparticules agrégation dans le flacon de collection était aussi un défi, particulièrement immédiatement à la sortie du dispositif microfluidique à quel point in situ gélification n’était pas complet et grand nombre de disponible réactif fonctionnelle des groupes étaient disponibles aux ponts de forme entre les particules en collision dans le bain de la collection. Ce défi a été corrigée par : augmentation de la longueur de la voie de sortie sur la puce microfluidique elle-même, maintenir les microparticules de gel à flux laminaire pour une plus longue période de temps pour favoriser la gélification plus complète ; Ajouter les chenaux secondaires après la buse pour nourrir plus de pétrole dans la puce et donc mieux séparer les microparticules de gel dans ce canal après mélange sans affecter les champs de cisaillement à la buse lui-même, ou le taux de production de particules ; et ajouter un agitateur magnétique le ballon de collection afin d’éviter la sédimentation au moyen de microparticules de gel et maintenir une plus grande séparation moyenne entre particules adjacentes. Bien que très lentes gélifiants polymères probablement améliorerait la stabilité de l’appareil et réduire au minimum les problèmes d’amorçage, ces systèmes ont également été observés à accroître sensiblement le risque d’agrégation de microparticules de gel, comme un plus grand nombre de groupes fonctionnels réactifs reste inaltéré (et donc en mesure de ponts entre particules forme) sur une longue période de temps. À ce titre, temps de gélification sur l’ordre de 15-60 s semblent être optimal pour cette technique : lent, assez pour permettre l’amorçage mais assez rapide assurer le plus réactif des groupes fonctionnels sont consommés avant les microparticules de gel de quitter le canal d’écoulement laminaire dans le flacon de collection.

Enfin, l’enlèvement des hydrocarbures aux modèles est essentiel de veiller à ce que les particules qui en résulte conservent que les propriétés smart attendu basé sur la composition des des prépolymères ajouté et permettre l’utilisation de ces particules dans un contexte biomédical. Le pentane procédure décrite de lavage a été très efficace à cet égard pour la production de microparticules de gel général. Toutefois, l’application de cette technique dans un contexte biomédical direct (p. ex., sur puce cell encapsulation) exigerait réévaluation du présent protocole. Nous avons également exploré l’utilisation de l’huile d’olive, a proposé d’être qu’une huile plus inerte dans le contexte de communiquer avec les cellules³⁶, comme le dispersant. Tandis que la formation de particules n’a pas été possible, les populations de microparticules de gel ont été significativement plus polydispersés que pourrait être réalisé avec de l’huile minérale, au moins avec la conception actuelle de la puce. Ainsi, alors que la puce semble être adaptable à la fois de polymère synthétique et de gel de polymère naturel au moyen de microparticules formation³¹, un mis à jour le dessin peut être requis pour exploiter cette technique plus largement dans l’ensemble de toutes les combinaisons possibles de matière.

Nanoscale hydrogels via réactive auto-assemblage
Nanogels ont été créés à l’aide d’un très large éventail de conditions, y compris les différentes concentrations de polymère de graine de traitement (0,5 à 2 % en poids), différents rapports de polymère crosslinking:seed (0,05 à 0,2), différentes températures (40-80 ° C), différents (mélange) des vitesses 200-800 tr/min) et le chauffage différent moments après l’addition de la RETICULATION polymère (2-60 min)²⁸. En termes de concentrations, les tendances observées sont généralement comme pourrait être prédit, que des concentrations plus élevées de polymère de semences conduisent à plus grande nanogels et des ratios plus élevés de polymère de crosslinker:seed conduisent à nanogels avec des densités plus élevées de crosslink et ainsi abaisser thermoresponsivities. Il convient de souligner que, augmentant le polymère de semences concentration trop élevée conduit finalement à l’agrégation par opposition à nanoaggregation, conforme à ce qui est observé dans le processus de précipitation classiques des radicaux libres pour la formation de vrac thermoresponsive nanogels³. Temps de chauffage plus courts se retrouvent également d’être favorables pour formant plus petites et plus monodisperses de particules. Nous émettons l’hypothèse que la tenue du nanoaggregate à plus longs à une température au-dessus de la LCST un ou deux de ces polymères précurseur augmente la probabilité d’agrégation sur nanogel collision, avec l’hydrophobie accrue de la liaison de l’hydrazone relatif à soit les précurseur aldéhyde ou hydrazide maléique groupes fonctionnels faisant cette agrégation plus probable, car le degré de réticulation obtenue est augmenté. En fin de compte, des temps de chauffage plus courts sont favorables dans une perspective de processus, car une population de nanogel monodisperses peut se former en aussi peu que 2 min après l’addition de reticulation de polymère ; 10 min s’est avéré le plus longtemps qui pouvait produire constamment monodispersés nanogels tout en permettant à la production de plus hautement réticulé nanogels. Fait intéressant, la méthode est remarquablement insensible au mélange, avec des tailles de particules presque identique et granulométries résultant du mélange à des vitesses différentes, ou encore mise à l’échelle du processus à des volumes plus importants. Bien que surpris par ce résultat, il est probable parle avec le rôle principal de la thermodynamique dans la régulation de la production nanogel.

Pour atteindre les polydispersités faibles, la stabilité colloïdale et le degré d’hydratation de la nanoaggregate semblent être les principales variables. Par exemple, nanoaggrégats préparés en utilisant les polymères fonctionnalisés hydrazide maléique plus hydrophiles comme la graine par opposition aux polymères fonctionnalisés aldéhyde moins hydrophiles entraîner nanogels avec polydispersités significativement plus faibles. La différence entre la température du montage expérimental et la LCST du polymère de semences est également essentielle. Fonctionnant à une température juste au-dessus du polymère de semences LCST ((T-LCST) < 5 ° C) vous propose la plus forte probabilité de formation de nanogel monodisperses ; bien au-dessus de la LCST crée plus nanoaggrégats s’est effondré et hydrophobes qui risquent plus globale et moins susceptibles de crosslink, tout en fonctionnant en dessous des LCST des résultats dans un polymère de semence relativement non compact qui ne peuvent être efficacement ou reproductible réticulé. Pour la meilleure prédiction des particules monodispersion, nous vous recommandons tout d’abord effectuer une analyse de UV/vis pour mesurer l’apparition LCST du polymère de graines et par la suite effectuer les processus d’auto-assemblage à une température de 1 à 2 ° C au-dessus de la LCST.

Notez que nanogels produites à l’aide de cette méthode pourrait être lyophilisés et redispersed sans aucun changement dans la stabilité colloïdale, souvent pas possible pour les structures auto-assemblées et à notre avis attribuable à notre méthode de stabilisation de réticulation. Nous prévoyons également que seulement le polymère de semences doit être thermoresponsive pour que cette méthode de travail ; utilisation de réticulation de polymères qui sont irrecevables ou sensible aux autres stimuli peut-être élargir davantage l’application ultime de cette technique. Enfin, le mélange de deux polymères réactifs précurseurs étant dans ce cas passive par opposition au temps de gélification active, est beaucoup moins important en termes de contrôle de processus par rapport aux autres stratégies de fabrication décrites. Cependant, même dans cette technique, gardant le temps total de réticulation < 30 min est souhaitable afin de minimiser le risque d’agrégation des particules.

Hydrogels Nanofibrous par électrofilage réactive
Contrôler le temps de gélification des polymères réactifs avant redevient essentiel à la réussite de la production de nanofibres de gel. En particulier, correspondant à environ le temps de séjour des polymères précurseur dans le mélangeur statique (contrôlée en changeant la vitesse d’écoulement de la solution de la seringue double barillet ainsi que la longueur et la tortuosité du mélangeur statique) avec la gélification en vrac temps des polymères précurseur est indispensable tant pour préserver le filage ainsi que d’assurer efficacement réticulation des fibres filés entre l’aiguille et le collecteur. Gélification rapide conduit au développement des cônes Taylor inefficace et donc filage pauvre, alors que plus lent gelation résulte dans une solution aqueuse au lieu d’un gel de frapper le collecteur, résultant dans la diffusion et la formation ultime d’un film mince de gel au lieu de nanofibres. Travaillant au temps de séjour un peu moins le temps de gélification en vrac a également été trouvé à être efficace (et en effet préférable de réduire le risque de colmatage de l’aiguille) car l’évaporation de l’eau que la solution tourne effectivement concentre les polymères de précurseur dans la Stream et donc accélère la cinétique de la gélification au cours du processus de filage. Dans cette même veine, opérant à des distances de l’aiguille-à-collector plus élevés (> 10 cm) est généralement favorable à ce processus, car une distance plus courte réduit le temps disponible pour l’évaporation de l’eau et nécessite donc un contrôle plus strict sur la relation entre temps de séjour et temps de gélification afin de préserver un produit de nanofibrous.

Notez que l’utilisation du PEO (ou une autre masse moléculaire élevée et facilement électrofilées polymère) est essentiel dans ce protocole pour promouvoir la formation de nanofibres, comme les oligomères POEGMA courtes et très ramifiées ne peuvent atteindre seul un niveau adéquat d’enchevêtrement d’induire électrofilage ; au lieu de cela, electrospray résultats à tous les processus de conditions testées pour les formulations POEGMA seule (bien que cela peut avoir également des applications pour la fabrication de particules de gel dégradables en utilisant cette même chimie). Une concentration minimale de PEO de 1 % en poids (1 MDa de poids moléculaire) est nécessaire pour maintenir une morphologie totalement nanofibrous. Notez que la PEO peut être retirée des fibres suite à une procédure simple trempage (eau déminéralisée, 24h) sans perturber l’intégrité du réseau nanofibrous ; de cette façon, PEO agit plus comme une aide transitoire électrofilage qu’une composante essentielle du produit final nanofibrous. Notez également que différents types de capteurs, y compris l’aluminium simple (pour créer des hydrogels de couche mince qui peut se décoller du collecteur après trempage) ainsi qu’un disque en aluminium (pour créer des échafaudages plus épais) peuvent être utilisés en conjonction avec ce même technique, fourni les autres variables de processus contrôlant le taux de gélification, le taux d’électrofilage et le taux d’évaporation de l’eau pendant électrofilage restent inchangés.

Fait intéressant, selon la méthode utilisée pour préparer les différentes morphologies, des différences significatives ont été observées dans les temps de dégradation des hydrogels préparés à partir des mêmes précurseurs d’hydrogel. Par exemple, POEGMA nanofibrous hydrogels se dégrade plus lentement que les hydrogels POEGMA en bloc avec la même composition malgré leur superficie nettement plus élevé et donc accès à l’eau d’hydrolyser les liaisons d’hydrazone. Nous relions ces différences pour les contrastes inhérentes entre les protocoles décrits en ce qui concerne la géométrie du mélange les polymères de précurseur, qui peuvent conduire au gel interne homogénéïtés et/ou de morphologies qui sont significativement différentes et/ou de la dans situ concentration de précurseurs de polymère sur la même échelle de temps que la gélification, particulièrement pertinente dans électrofilage due à l’évaporation de l’eau simultanée et réticulation observée dans ce processus. Même si cela peut un peu compliquer le choix des polymères précurseur si un polymère est ciblé pour utilisation dans chaque protocole, il peut aussi offrir une possibilité technique en termes de prise des hydrogels avec une composition chimique, mais des propriétés physiques très différentes.

Dans l’ensemble, les méthodes décrites offrent une stratégie de fabrication dégradables (ou au moins insuffisants libérable) analogues de polymères thermoresponsive sur plusieurs échelles de longueur (en vrac, micro et nano) et avec plusieurs types de structures internes (particules ou fibres). Ces protocoles aborder les principaux obstacles à la traduction réussie des matériaux préparés conventionnellement synthétique thermoresponsive pour le domaine biomédical : injectabilité et dégradabilité. Nous continuons à étudier l’application de ces matières dans l’administration de médicaments et de tissus techniques des applications allant de la physique ciblant des cancers, le transport de drogues à travers la barrière hémato – encéphalique, la prestation thérapeutique des protéines à l’arrière de le œil, la croissance directionnelle des tissus et l’adhérence THERMORÉVERSIBLE et différenciation des cellules, parmi d’autres applications.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financement par les Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil du Canada (CRSNG), le CRSNG CREATE-IDEM (conception intégrée de Matrices extracellulaires) programme, 20/20 : réseau de recherche biomatériaux ophtalmique du CRSNG et le ministère de la recherche de l’Ontario et Programme de bourses de nouveaux chercheurs d’innovation est reconnu.

Materials

Chemicals
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester	Wako Chemicals	101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA)	Sigma Aldrich	447927	188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475)	Sigma Aldrich	447943	475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99%	Sigma Aldrich	147230
Thioglycolic acid (TGA), 98%	Sigma Aldrich	T3758
Dioxane, 99%	Caledon Labs	360481
Nitrogen, UHP grade	Air Liquide	Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98%	Alfa Aesar	A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%)	Carbosynth	FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37%	Sigma Aldrich	320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97%	Sigma Aldrich	221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99%	Sigma Aldrich	121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97%	Sigma Aldrich	176141
Methacryloyl chloride,97x%	Sigma Aldrich	523216
Petroleum ether, 95%	Sigma Aldrich	32047
Magnesium sulfate, 99.5%	Sigma Aldrich	M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0%	Sigma Aldrich	443808
Phosphate buffered saline	BioShop	PBS405.1	1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99%	J&K Scientific	258717	Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous	Commerical Alchols	P016EAAN
Span 80	Sigma Aldrich	S6760
Heavy paraffin oil	Caledon Labs	1326197
Pentane, reagent grade	Caledon Labs	1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000	Sigma Aldrich	182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator	Heidolph	G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off)	Spectrum Labs	28170-166	Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness	McMaster-Carr	9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump	KD Scientific	KDS Legato 200	Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply	Spellman	230-20R	0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer	University Wafer	2080	D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation
SU-8 100	MicroChem	Y131273
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100
Custom 2.5" spincoater	Built in-house	N/A
Mask Aligner	KARL SUSS	MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing	Cole Parmer	OF-96400-13	Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base	Ellsworth Adhesives	4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Ellsworth Adhesives	4019862
High Power Plasma Cleaner	Harrick	PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester	Biomomentum	LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate	Greiner Bio-one	665 180
Cell culture insert for 12 well plate	Corning	08-771-12	8 µm pore size
Optical microscope	Olympus BX51 optical microscope	BX51
Temperature-controlled microscope stage	Linkam Scientific	THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC)	Waters	590 HPLC Pump	Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS)	Brookhaven	90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM)	TEMSCAN	JEOL 1200EX	Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM)	Tescan	Vega II LSU	Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher	CellScale Biomaterials Testing	MS-50M-01

Referencias

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Citar este artículo

Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).