STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

注：末梢血好酸球は、健康科学治験審査委員会のためにウィスコンシン大学マディソンセンターの大学（＃2013から1570）承認されたプロトコルに従って、情報を特定せずに受信されました。ドナーから署名されたインフォームドコンセントは、研究中の各サンプルの使用のために得られました。 1.テンプレートの基準としてプラスミドを作成します 表1aあたりとして5'- をKpnIおよびNheI制限部位（5'-拡張子）で、両方のSTAT3スプライス部位にまたがるアンプリコンのためのプライマーを作成します。 注： のKpnIおよびNheI部位を、カナマイシン耐性25,26と修正されたPET-28Aベクター中に連結される挿入を可能にするために選択されたKpnI部位は、マルチクローニングサイトに追加されていました。 細胞培養培地中に2.5×10 6細胞/ mlの複製サンプルを準備し、新たに寄贈好酸球を使用して（ロズウェルパークメモリアリットル研究所（RPMI）1640培地）。 5％CO 2および10％湿度下で37℃で1時間インキュベートします。 RNA抽出およびcDNA合成キットを使用してあたり、製造業者の説明書のようにサンプルからの相補的（c）のDNA（調製あたり少なくとも1×10 6細胞）を準備します。 ステップ1.2.1で調製した鋳型cDNAから増幅STAT3スプライスは、 表ごとに図2aとして増幅PCRを用いて変異体です。 2％アガローストリス-酢酸、エチレンジアミン四酢酸（TAE）ゲル27内のアンプリコンを解決します。消費税ゲルからバンドとゲル切除キットの説明書に従って精製します。 ボリューム、インキュベーション時間および温度を使用して、適切な制限酵素（参照27における制限の概要）、とカットアンプリコンプラスミドは、酵素プロバイダによって推奨します。ステップ1.4のように精製します。プロバイダの推奨条件でプラスミドに制限されたアンプリコンを連結。 負の続きを準備ROL（インサートを含まないが、リガーゼを用いて制限されたプラスミドDNA）およびポジティブコントロール（カナマイシン耐性を持つ無制限プラスミド）。コンピテントE.の標準的なプラスミド変換を実行ライゲーション混合物27を使用して大腸菌 DH5α28。 形質転換されたE.インキュベート 37℃で1時間振とう（27指示されるように調製）を1mlのルリア・ブロス（LB）培地中で大腸菌 。 50μg/ mlのカナマイシンを含有するLBプレート上で形質転換体を広げ、37℃で一晩インキュベートします。 滅菌爪楊枝27を使用して、STAT3の αおよびSTAT3の β版からいくつかのコロニーを選択してください。 2ミリリットルのLBにそれぞれの転送振盪インキュベーター中で37℃で一晩培養物を成長させます。 DNA精製キットの指示に従うことにより、細菌の培養物からプラスミドを精製します。 -20または-80℃で保存プラスミド。 シーケンスは、20μlの配列決定反応を調製することにより、いくつかのコロニーからプラスミド。ピペット3μlのシークエンシング反応バッファー、2μlのシークエンシング反応ミックス、12μlの超純水、テンプレートと2μlのシークエンシングプライマーとして1μlのプラスミド。 注：PET-28Aベクターを使用している場合、「配列決定プライマー5'-TAA TAC GAC TCA CTAタグGGG-3を使用します。 Sα、Sβ、ΔSαとΔSβ25：各変異体をコードするプラスミドのelectrophoretogramsを評価します。 NG /μlの中で純粋なプラスミドDNAの測定濃度。分光光度計を用いて260nmで吸光度を読み取る場合は、ランベルト・ベールの法則29を使用して、DNAの濃度を計算します。 ここで、c =濃度、A =吸光度、ε（吸光係数）= 0.02（/ mlの）-1 cm -1 で二重鎖DNAとの光L =光路長（通常1センチ）のために。 STAT3スプライスバリアントのcDNA AMの分子量を使用してpliconsおよびベクターは、1μl当たりのコピー数を計算します。 注：塩基対（bp）の1個当たりの分子量が650ダとして推定されます。 2.絶対定量PCR用のプライマー特異性を分析します超純水を使用して、1μl当たり〜8月10日から3月10日までコピー（20μl）を用いて、STAT3プラスミドの10希釈系列に1を準備します。最も集中の測定濃度（1μl当たり〜10 8コピー、ステップ1.11を参照してください）。 4つの「非標的」ミックスを準備するために希釈されたプラスミドを使用してください（ すなわち 、STAT3Sα、ΔSα、Sβが、無ΔSβの等しい濃度を含むSTAT3ΔSβネガティブコントロール）各1μl当たり10 6コピーで。 1μl当たり10 6コピーにすべての4つのテンプレートそれぞれの等濃度で「ターゲット」ミックスを調製します。 プライマー対溶液を調製します7μMの濃度で、プライマーの〜60μlの各することにより、各スプライスバリアント（ 表1bおよび図1を参照）（試料中の最終濃度は560 nMのであろう）のための。 純粋なH 2 Oで5：DNAポリメラーゼ/二本鎖DNA結合色素ミックス7を希釈テンプレート（ 表3）に示すように、96ウェルPCRプレートにアッセイ1を設定します。 DNAポリメラーゼ/二本鎖DNA結合色素ミックス希釈21μL、その後プライマーミックス2μlのと（ 表2bあたりなど）テンプレートの2μLを加えます。代わりにテンプレートの、よく鋳型なしコントロール（NTC）にH 2 Oフィルタリング2μlを添加します。再現性30を評価するために、重複での反応を設定します。 接着カバーと12℃で1200×gで5分間遠心分離器とシールのqPCRプレート。 記載されているように材料に記載されているソフトウェアを使用する場合は、実験を設定します。 定量PCR機の電源を入れ、密封された定量PCRプレートを挿入します。 [ファイル]をクリックします＆＃62; [新規作成]> [次へ>、「新しい検出器」を選択してレポーターを選択し、クエンチャーと名前を入力します。各スプライスバリアントのための「新しい検出器」を設定します。 量を確保し、[次へ]を選択し、設定サンプルプレートページに促されるような基準を設定するには、表に入力され、適切な検出器が選択されています。 [完了]をクリックします。 表2bごとにサイクリングを設定します。 （CTを決定するために）、その蛍光が読んで確認し、各サイクルの72℃のステップの間に起こります。ファイル名を指定して実行]を選択します。 実行が完了すると、[結果]タブ>増幅プロット]タブをクリックします。 （ 図2のように 、指数関数のプロットを探してください）データの品質を評価するための出力増幅プロットを評価します。 注：確認増幅プロットは、ほとんど指数関数、サイクル閾値はプロットの指数部に設定することができるということです。 NTCはが増幅されていないことを確認し、他の標準的なポイントが高いΔRnと低いCt値を示しています。 EXPへortがファイル]> [エクスポート]> [結果]をクリックし、表計算ソフトになります。 3.絶対定量PCRアッセイ特異性と再現性を評価します再現性 CT（蛍光のための閾値サイクル）値の標準偏差を計算するステップ2.7.5からのデータを使用してください。 ここで、N =サンプル数（2連で行われていれば）、 =サンプルのCTおよび =サンプルCtが意味します。重複のCt値の標準偏差が≤0.2であることを確認してください。すべてが、NTCウェルにおけるCt値が38よりも小さいことを確認してください。 再現性は増加または減少アニール時間によって貧しい最適化サイクルパラメーターである場合。 しびれプロットログ・コピーER（ステップ1.12で決定し、ステップ2.1で調製した）Ct値対 標準曲線を作成します。以下の式が得られます。 yがコネチカットここで、mは勾配であり、xは 、ログ（コピー数）であり、Bは切片値です。 注：線形回帰のR 2値は、良好なデータのために≥0.95となります。 標準曲線と式を用いて増幅効率を計算します。 注：効率≥75％を目指します。 あまりにもの式を用いて定量PCRアッセイ1から特異性を計算します。 ここで、Δ のCt すぎる = たCt 標的 -特異的および非特異的なアンプのための閾値サイクル数の差を説明するCt 非ターゲットlification 注：特異性は、4桁を超えている必要があります（ すなわち 、特異性因子を≥4。）。 特異性が悪い場合には、プライマー濃度を低下させることによって最適化します。 100〜500nmの範囲の最終プライマー濃度と（ステップ2.5から2.7に記載されているように）アッセイを設定します。 4.相対定量PCRアッセイを行います転写を促進するサイトカインで細胞を処理します。 新たに寄贈好酸球は、細胞培養培地中2.5×10 6細胞/ ml（RPMI 1640培地）の複製サンプルを準備し、（50 ngの/ mlのインターロイキン3（IL3）、および/または50 ngの/ mlの腫瘍壊死因子αで処理5％CO 2および10％湿度下で37℃で3、6、9、20時間の期間TNFα）。 RNA抽出およびcDNA合成キットを用いて、製造元の指示に従って、好酸球のサンプル（準備あたり少なくとも1×10 6細胞）からcDNAを準備します。 </li> 「1」から「1024年における1「希釈に希釈範囲で、2つのサンプルのcDNAアリコート（制御または安静時のサンプル）の連続希釈液を調製します。 1 4で希釈、ピペット1μlのcDNA及び3μlの超純水のため。 1 16で希釈するために、1のピペット1μlの4希釈し、3μlの超純水などで （ 表4のテンプレートを参照してください）2.3から2.5まで説明したステップとしてではなく、パンSTAT3およびGUSBのためのいくつかのプライマー濃度で25μlの反応を96ウェルプレートにPCRを設定します。 GUSBは、「新しい検出器」を追加して、 表2cに記載サイクリングパラメータを使用して、手順2.6から2.7に従ってください。 濃度は95から100パーセントの増幅効率につながるどのプライマーを決定する（ステップ3.2と3.3を参照してください）標準曲線を生成します。 （ステップ4.2）から調製したcDNAサンプルおよび最適化されたプライマー濃度でプレートを設定します（サイクリングパラメータ、試薬および表5に 、96ウェルプレートテンプレートの表2Cを参照）。 手順2.6から2.7を実行します。少なくとも一回アッセイを繰り返し、データ品質を確認してください。 STAT3およびハウスキーピング遺伝子GUSBの両方に重複したサンプルのCtの平均Ct値を計算します。 各サンプルのΔCt値を取得します。 各サンプルのサンプル0計算ΔΔCtを 31（ここではサンプルXとして指定）として（通常は関心の転写物の最も低い濃度を有する）のサンプルを休んで指定： 各サンプルの増加倍数を計算します。 再現性汎STのためのコピー数の変動係数（CV）を計算AT3とGUSB。 ここで、N =サンプル数、=サンプルの計算されたコピー数と=標本平均。各サンプルのCV（複数のアッセイ）は≤10％であることを確認してください。 5.未知のサンプルのために絶対のqPCRデータの分析サンプル」のcDNA濃度が一桁以内であることを確認するために、ハウスキーピング遺伝子GUSBのために（ステップ4.9で説明したように）相対定量PCRで得られたCt値を比較します。 希釈cDNAはそれに応じて（ 例えば、試料1〜17.5のCt値を有し、他のサンプル「Ct値である場合〜21、サンプル1は、大きく2（21から17.5）が 11倍以上濃縮= 1行います。で1希釈必要以上に希釈せずに同じ範囲内で超純水）。 注：非常に異なる開始濃度は（ステップ4.1を線形回帰分析を偏らます2）。 サンプルの絶対定量PCRアッセイを設定します。 表6のとおりSαとSβのためのアッセイ2aのテンプレートプレートを準備します。 表7の通りΔSαとΔSβためのアッセイ2bとを準備する。ステップ2.6-2.7.3（および表2b）に記載されているようにアッセイを実施します。少なくとも一回のアッセイを繰り返します。 ステップ2.7.4-2.7.5で説明したように、データの品質とエクスポートを確認してください。 汎STAT3プライマー （ 表1cの中のプライマー、 表8のテンプレート）400μMで、すべての4つのプラスミドのミックスまたは記載されている総濃度で単一のプラスミドを用いて、25μlの反応と絶対定量PCR 96ウェルプレートを設定します。 注：効率は絶対定量PCRのために重要ではなく、これらのプライマーの効率を最適化することは、相対定量PCR（ステップ4）のために重要であるしません。 接着カバーと12℃で1200×gで5分間遠心分離器とシールのqPCRプレート。 パンのための「新しい検出器」を設置-ステップのようにSTAT3 2.7.1-2.7.3。 表あたりの図2c（相対定量PCRと同じ条件）としてパンSTAT3のためにサイクリングを設定します。 （CTを決定するために）、その蛍光が読んで確認し、各サイクルの72℃のステップの間に起こります。再現性を確保するために、少なくとも一回アッセイを繰り返します。 （2.7.4-2.7.5手順を参照）データ品質およびエクスポートを確認してください。 増幅プロット（ 図2参照） が指数関数でない場合は、サンプルのcDNA（1:10）希釈し（ステップ5.7）に記載のようにアッセイを繰り返します。 標準曲線の式を用いて各スプライス変異体の、各サンプル中のパンSTAT3のコピー数を計算し、サンプルのCt値（ 図3の 3.2を参照）。 プロットログSTAのログ（累積絶対定量PCRコピー数の値対（パンSTAT3のために得られた絶対定量PCRコピー数値）T3スプライスバリアントを）。 注：理想的な線形回帰とスロープの値は、両方の〜1になります。 再現性（ステップ3.1）および再現性（ステップ4.13）を計算します。 6.絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ各スプライスバリアントの増加倍率を算出する総STAT3の増加倍率を有する変異体の割合を掛けます。 エラーの伝播を考慮して絶対と相対値の標準偏差（ステップ3.1.1を参照）を計算します。示すように、測定の標準誤差（SEM）を決定します。