절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기
Summary
Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.
Abstract
Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3‘s four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants’ levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.
Introduction
단거리 대체 셉터 또는 도너 사이트는 서로 가까운 위치에 (탠덤) 스 플라이 싱은, 포유류 1 무척추이 식물 3에서 일반적이다. 포유 동물 유전자의 20 % 대체 스플 라이스 부위 떨어져 2-12 뉴클레오타이드 4를 포함하는 것으로 추정된다. 이러한 사이트의 대부분은 3 개의 뉴클레오티드 떨어져 단일 코돈의 포함 또는 제외 될. 다른 사람들이 조직 특이성 (8)에 따라 규정을 유추하면서 접합 모티브 차이가 선택 확률 7 너무 미묘하다 몇 가지 논쟁과이 사이트 5,6에 접합 규제의 성격에 대한 논쟁이있다.
탠덤 접합 부위의 선택은 변형 된 모세관 전기 영동 (7) 및 고해상도 겔 전기 영동 (8)를 이용하여 반 정량적으로 분석되었다. RNA-SEQ (RNA 서열)은 각 접합부에서 접합 비율을 정량하는 데 사용될 수 읽기대지. 이러한 방식으로, RNA-SEQ 데이터 탠덤 접합 부위 (9)의 조절에 대한 통찰력을 제공했다. 또한 염기 모티브 (10)에 따라 예상 스플 라이스 변형 비율의 예측을 사용할 수있다. 포함 또는 하나의 코돈 (N은 어떤 뉴클레오티드를 =) NAGNAGs로 알려진 더 일반적으로 발생하는 탠덤 수용체 스플 라이스 사이트에있다 제외 접합에 대한 강조의 대부분.
(Y는 피리 미딘을 = GYNGYN 인식 모티브를) 포함 또는 하나의 코돈을 제외한 직렬 기증자 대체 스플 라이스 사이트는 탠덤 수용체보다 일반적이다. 신호 변환기 및 전사 3 (STAT3)의 활성화는 탠덤 기증자 대체 접합 1,11을받은 핵심 유전자이다. 탠덤 접합 공여체 부위는 엑손 (21, 22)를 결합하고 세린 701 (S 또는 각각 ΔS) 1,11 대한 코돈을 포함 또는 제외 될. (40 뉴클레오티드 서로 떨어져) 다운 스트림 대안 수용체 사이트에 가입 엑손 (22)전이 활성화 도메인 (α) 7 고유의 C 말단 잔기 (β) (11)와 절단 된 전이 활성화 도메인의 55 단자 잔류 하나의 포함에 23A / B의 결과입니다. 따라서, 네 개의 접합부의 변형이 가능하다.
STAT3 단백질은 다양한 세포 유형 12 전사 인자 및 주요 신호 통합과 돌연변이 때 그 구성 적 활성화 (참고 13에서 검토) 여러 가지 암의 표현형에 기여한다. 욥의 증후군, IgE의 높은 수준의 특징으로하는 면역 결핍 질환이 또한 STAT3의 돌연변이에 의해 발생합니다 (참고 14에서 검토). STAT3의 α와 β 스플 라이스 변형 단백질에 대한 고유 한 역할이 이전 된 15 설명했다. 처음에, STAT3 β는 STAT3의 α의 전사 활성을 길항, 지배적 인 음성 방식 (16)에 작용하는 것으로 생각하지만, 이후의 작업은 독립적 인 표적 유전자 (17)가 제안되었다 </s>입니다. 탠덤 접합의 미묘함에도 불구하고, 부재 또는 세린-701 (Ser701) 영향 함수의 존재를 믿을만한 이유가있다. 뿐만 아니라 Ser701은 티로신-705 (STAT3 활성화 18 인산화 잔류 물)에 근접하지만, 최근의 연구는 STAT3 S와 ΔS 스플 라이스 변종 STAT3 중독 확산 대형 B 세포 림프종 (DLBLCL)의 생존을 위해 모두 필요하다고 제안 세포 19. 생물학적 관련성 탐구 일이다. 스플 라이스 변이체 조성물은 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 감안하면 비가 호산구 사이토킨 자극에 의해 교란 된 주는지 노력.
우리는 처음에 S 스플 라이스 변종, AfeI에 대한 특정 제한 효소와 제품의 절단 다음 STAT3의 α와 β 스플 라이스 변종에 대한 PCR의 특정을 사용하여 두 개의 접합 이벤트 사이의 연결을 탐구하려고 시도했습니다. Ser701이 연구되었다의 제품 농도계는 포함을 표시씼어 열 배 더 많이 STAT3의 α와 β 모두의 누락 (ΔS)보다 (데이터가 표시되지 않음). 그러나,이 반 정량적 인 접근을 충분히 재현되지 않고, 네 개의 접합부를 동시에 측정하는 변형을 유효하게 이용할 수 없었다. 네 스플 라이스 변이체의 각각의 비율을 분석하기 위해 꽉 기술 (주어진 샘플 여러 분석)을 수득 정량적 PCR (qPCR에) 프로토콜을 설정할 필요가 있었다 복제.
상대 qPCR에 특정 레벨 (20)에서 발현되는 것으로 공지 된 표준 또는 하우스 키핑 유전자를 관심있는 유전자의 비교에 의존 관심과 하우스 키핑 유전자의 유전자 유사한 효율로 증폭하는 경우에 적합하다. 이중 가닥 (DS) DNA 결합 형광 (시아닌) 염료는 PCR의 증폭 (21)에 결합하고,주기의 특정 숫자 후, 충분한 증폭 검출로 형광을 위해 발생했습니다. 높은 초기 레벨사체의 하부 역치 사이클 (CT) 값. cDNA의 제제의 농도가 상이하기 때문에, 하나의 호산구 22-β 글루 쿠 (GUSB) 등 모든 샘플에서 일정한 수준으로 발현되는 것으로 공지 된 전 사체의 농도 사체의 농도를 비교할 필요가있다.
상대 qPCR에 탠덤 접합으로 인한 스플 라이스 변종에서 볼 수 있듯이, 매우 유사한 시퀀스 가능하지 않습니다. 구체적 스플 라이스 변이체를 증폭하기 위해 필요한 엄격한 조건이 효율 저하를 초래한다. 대신, 절대 정량 (23)를 사용해야합니다. 이는 관심의 접합 사체의 알려진 농도의 표준 곡선을 준비하는 것을 수반하고, 보장 PCR 조건은 24 특이성을 최적화한다. 설명한 바와 같이, 특정 유전자에 대한 절대 및 상대 qPCR의 데이터에 특정 세포 유형으로 유전자의 발현에 대한 이해를 알리기 위해 병합 될 수있다다양하게 자극 호산구 (25)이 경우 STAT3.
여기서, STAT3 스플 라이스 변이체 정량화 방법은 다른 탠덤 접합 이벤트 대상 연구에 적용 할 수 있다는 기대를 설명한다. 최적화는 다양한 농도와 자전거 매개 변수의 다수의 반복에서 여러 프라이머 쌍은 몇 달에 걸쳐 시험 하였다 긴 과정이었다. 프로토콜의 주요 기능은 스플 라이스 변종의 알려진 농도의 표준 곡선에 따라 프라이머 특이성 검증 및 정량화 있습니다. 함께 상대 qPCR에 우리의 응용 프로그램에 도움이 입증하지만 필요가 없습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 호산구 및 림프종 세포의 수준과 STAT3 스플 라이스 변형 성적의 비율을 평가하고 사이토 카인의 자극 수준과 비율에 영향을 여부를 배우기 위해이 프로토콜을 개발했다. STAT3는 암의 암 단백 또는 종양 억제 역할을하는지 여부에 대한 보고서를 충돌로 때문에다면 발현과 불확실한 기능이 특히 관심이다 (참조 33에서 검토). STAT3의 α와 β 스플 라이스 변형 기능의 차이는 이전에 (34, 35)을 특징으로했다, 우리의 프로토콜은 S의 최적 비율에 대한 필요성을 제안 노크 다운 / 다시 발현 분석을 용이하게하고 ΔS 19 성적 증명서.
독특한 스플 라이스 변종의 정확한 정량이 변형 구성을 스플 라이스 이기종 STAT3 기능을 관련의 추가 조사를 촉진 할 것이다. 프로토콜은 AB의 능력과 함께, 절대 및 상대 qPCR의 데이터를 통합하여용질 qPCR의 스플 라이스 변이체의 비율을 계산하고, 상대적인 qPCR의 전체 STAT3 발현의 변화를 측정. 이 방법은 한 50 개 이상의 뉴클레오티드 떨어져 두 개의 다른 스플 라이스 사이트에서 스 플라이 싱 비율을 순차적으로 미묘한 차이를 구별 동시에 측정 할 수 있습니다. 개별적으로 접합 이벤트의 비율을 결정하는 것은 공동 접합 바이어스 ΔSβ 레벨이 두 사이트의 사용은 임의로 25를 접합하는 경우 예상되는 이상이되도록 존재하는 놀라운 발견을 수득 않았을 것이다.
비판적 플라스미드 검량선을 사용하여 절대 qPCR에 매우 유사한 서열 될 스플 라이스 변이 (차선 효율) 정량 할 수있다. 우리는 새로운 미묘한 스 플라이 싱 qPCR에 분석을 최적화하기 위해 크게 2 개월이 걸릴해야합니다 기대하고 있습니다. 시험 개발의 주요 단계는 절대 qPCR에 대한 표준 곡선을 생성하는데 사용 된 플라스미드 STAT3의 생성이다; 실험적으로특이성 및 재현성을 보장하기 위해 최적의 프라이머 서열 및 사이클 파라미터를 결정하는 단계; 상대 qPCR의 데이터의 통합은 GAPDH 발현에 팬 STAT3 발현 상대적인 정량으로부터 산출했다. 누적 정량화 대 STAT3를 췌장염에 의해 정량화 카피 수의 상관 관계 (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) 프로토콜은 신뢰할 수있는 결과를 보여줍니다.
기술의주의해야 할 점은 광범위한 검증 과정이다. 내 분석 변동성 (반복성), interassay 변동 (재현성)와 특이도를 평가할 필요가있다. 프로토콜은 이러한 매개 변수에 대한 숫자 출력을 얻을 수있는 방법을 설명합니다. 우리는 효율성을 특이 요인 ≥4, 변화 (재현성)의 계수 ≤10 %와 코네티컷 표준 편차 (반복) ≤0.2 적합한 임계 값 (30) ≥75 %로 간주. STAT3 시퀀스 아미노산 1-690의 돌연변이 또는 삭제는 discove 수 없습니다이들이 접합 비율에 영향을 미칠 수 있지만,이 프로토콜에 의해 레드. 성적 비율은 비율 36 proteoform에 비례하지 않을 수 있습니다.
샘플 전체의 cDNA의 시작 양을 다른했기 때문에, 절대 qPCR에가 설립 하우스 키핑 유전자를 사용하여 상대 qPCR에 결합하지 않는 한 간 샘플 비교 샘플 내에서 스플 라이스 변종의 사본 번호를 비교하지만 적합합니다. 이 방법은 재현성 30 MIQE qPCR에 가이드 라인을 준수 설명했다. PCR 사이클링 변수와 프라이머 농도는 다른 장치를 사용하는 경우 재현 데이터를 얻기 위해 수정 될 필요가있다. 완전한 특이성이 크게 저하하지 않고 효율이 불가능하지만, 타겟 크기 순서의 4보다 큰보다 효율적 증폭 하였다.
선형 DNA는 쉽게 원형보다 증폭된다. 다른 플라스미드 만족 표준 곡선을 제공하지 않는 경우 (R 2 <; ) 0.95은 정량화하기 전에 단일 사이트 제한에 의해 플라스미드를 선형화 고려합니다. qPCR에 최적화 좋은 품질의 데이터를 (그림 1)을 얻기 위해 매우 중요하다. 대부분 qPCR의 프로토콜은 두 단계의 순환에 의존하고, 따라서 시스템이 최적화된다. 가열 블록의 불균일 한 가열이 불량 재현성에 기여 세 단계 사이클링에서 악화 될 수있다. 분석은 이상적으로 전용 층류 후드, 필터 피펫 팁 및 초순수와 멸균 조건에서 설정해야합니다. 오염 물질이 일치하지 않는 결과가 발생할 수 있기 때문에, 분석은 이상적으로 전용 층류 후드, 필터 피펫 팁 및 초순수와 멸균 조건에서 설정해야합니다. qPCR에 최적화에 대한 자세한 내용은, 풍만한 등을 참조하십시오. (32)
STAT3를 정량화하는 것은 상황의 숫자에 큰 통찰력으로 이어질 수 있습니다. STAT3의 자신의 식 (37)을 자동-조절, 위에서 설명한 프로토콜은 도움이 될 수 있습니다STAT3 스플 라이스 변종의 비율이 긍정적 인 피드백 루프를 조절에 기여 여부를 규명한다. 프로토콜은 상이한 밀도 38 또는 개발의 과정을 통해 세포에서 관찰 된 바와 같이 스플 라이스 변이체 비율의 변화를 연구하는 데 이용 될 수있다 : 그것은 알려져있다 조혈 16 동안 단백질 수준에서 STAT3 α / β의 비율이 변화한다. Sundin 등. 발견 작업 증후군 39 환자의 STAT3의 엑손 (12)의 인트론 단일 염기 다형성 바이어스 플라이 싱. 또한 엑손 21, 22, 또는 22, 23 엑손 사이의 인트론에 존재하는 다수의 SNP 중 하나는 각각 ΔS / S 비율의 접합 및 α / β에 기여할 수 있다는 것을 생각할 수있다. 분석은 스 플라이 싱 규제의 돌연변이 또는 변경이 스 플라이 싱 과정 (40)에 바이어스를 도입 할 수 암 세포에서 STAT3의 성적을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 스 플라이 싱 인자의 돌연변이 (SF3B1 등) observ로골수이 형성 증후군 (41)의 에드 또한이 프로토콜에 의해 측정 될 수있다 변경 될 수 있습니다.
더 광범위하게,이 방법은 특히 종래 RNA-SEQ 않으며 qPCR에 표준으로 가능하지 접합에 동시 연결을 검출한다. 상호 배타적 인 엑손 접합의 현상이 스 플라이 싱 의사 결정의 조정을 설명하는 동안, 다른 접합 이벤트의 공동 협회는 잘 연구되지 않았습니다. 전장 cDNA를 심문하도록 RNA-SEQ가 수정 된 최근에 기재된 다른 방법은, 먼 접합 이벤트 이상의 공동 의존 이전 42 생각보다 암시한다.
STAT3는 기증자 탠덤 스플 라이스 사이트를 포함합니다. 수락 탠덤 접합 부위 (43)는 더욱 빈번하고 설명 프로토콜의 원리 NAGNAG 접합 200 뉴클레오티드 내의 다른 접합 이벤트의 일치 검출을위한 검정의 개발을위한 시작점이 될 수있다. 기타 poten은 최초 응용 프로그램은 삽입과 삭제 또는 더블 / 트리플 염기 다형성 (44)와 같은 다른 미묘한 서열 차이의 우연의 정량화를 포함한다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P01HL088584 : 저자는기도 염증과 리모델링에 호산구의 역할에 프로그램 프로젝트 그랜트 건강-NHLBI의 국립 연구소를 인정하고 싶습니다 (PI : N. Jarjour), 위스콘신 카르 보네 암 센터와 의학 교실 대학 교내 자금. 우리는 네 STAT3 변형 복제에 대한 더글러스 Annis가 감사합니다.
Materials
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
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