준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
막 단백질 (의원)은 세포막 및 기본 약물 표적의 필수 구성 요소입니다. 합리적 약물 설계는 일반적 결정학에 의해 얻어진 정확한 구조적 정보에 의존하고; 그러나 의원은 결정화하기 어렵다. MP 구조 결정에 최근 진행 싱크로트론 소스에서 기존의 결정 데이터를 수집하는 동안 방사선 손상으로 고통 일반적으로 잘 회절 산출 지질 입방 단계 (LCP) 결정화 방법,하지만 종종 작은 결정의 개발에 크게 도움이되고. 차세대 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 매우 밝은 펨토초 펄스를 생성 소스의 개발이 없거나 무시할 방사선 손상과 미세에서 실내 온도 데이터 수집을 사용할 수있다. 직렬 펨토초 결정학 (LCP-SFX)과 LCP 기술을 조합 한 우리의 최근의 노력은 승 여러 인간 G 단백질 결합 수용체의 고해상도 구조 이어질HICH 구조 결정에 대한 악명 어려운 대상을 나타냅니다. LCP의-SFX 기법에서, LCP는 결정 학적 데이터 수집을위한 XFEL 빔 주사 스트림의 교차점 MP 미결정 모두 성장 및 전달을위한 매트릭스로서 채용된다. 그것은 단지 서브 – 10 μm의 결정을 사용할 수있는 경우 LCP-SFX 실질적 또는 회절의 해상도를 향상시킬 수 있음을 입증되었다 실온에서 작은 결정의 사용은 결함의 축적과 같은 큰 cryocooled 결정과 연관된 다양한 문제들을 극복 할 수있는 경우에는, 높은 mosaicity 및 cryocooling 유물. X 선 소스와 검출기 기술의 미래 발전은 XFELs에서뿐만 아니라, 더 접근 싱크로트론 빔라인에서뿐만 아니라 구현을위한 일련 결정학은 매우 매력적이고 실용적인해야한다. 여기에서 우리는 일련 결정학 실험에 대한 LCP의 준비, 특성화 및 미세 결정의 전달을 위해 상세한 시각 프로토콜을 제시한다.이러한 프로토콜은, 주사기에서 결정화 실험을 검출 및 결정 샘플의 특성, 결정 밀도를 최적화하는 상기 주사 기기로 미결정 라덴 LCP 로딩 및 데이터 수집을 위해 상기 빔에 샘플을 제공하기위한 방법을 포함한다.
Introduction
X 선 결정학은 막 단백질 (MPS)의 원자 해상도 구조를 해결하는 현재까지 가장 성공적인 방법이다. 또는, 메소 결정화 또한 지질 입방 상 (LCP)로 알려진 지질 중간상으로부터 결정화는 G 단백질 결합 수용체로서 도전 대상의 고해상도 구조 결정을 활성화 한 MP 결정학의 주요 개발 중 하나 (의 GPCR을 나타낸다 1). LCP 도구와 기술의 최근 발전은 세계 2 주위에 구조 생물학의 큰 커뮤니티에 사용할 수있는이 기술을 만들었습니다. 그러나, 많은 경우에 LCP에 형성 MP 결정은 높은 해상도에서 충분한 신호 (3)를 수득 할 수 있기 전에 샘플이 심한 방사선 손상 및 열화 고통 심지어 가장 진보 된 마이크로 포커스 싱크로트론 빔라인을 사용하기에는 너무 작다.
결정 데이터 수집에 대한 새로운 접근 방식최초의 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL)의 시운전으로 활성화되었습니다. 방법은 "파괴하기 전에 회절"의 원칙, 최초의 이론적 4를 도입하고 선형 가속기 코 히어 런트 광원 (LCLS) 3, 하드 XFELs에서 세계의 개척자에서 생물학적 시료에 실험적으로 확인을 기반으로합니다. XFEL 단백질 원자 방사선 손상에 응답하여 이동하기 전에 원시 결정에서 회절 펨토초 기간 내에 수십 고휘도 X 선 펄스를 생성한다. 초기 실험에서, 미세 연속 액체 분사 장치 (5)에 의해 제조 된 수성 스트림의 XFEL 빔 교차점에 공급 하였다. 이 실험 장치는 시리얼 펨토초 결정학 (SFX)로 알려져있다. SFX위한 액체 분사 장치를 사용하는 주요 단점은 결과적으로 전체 데이터 세트의 수집을 위해 정제 된 단백질 밀리그램 수십에서 수백를 필요로 높은 유량이다. EMP으로현저히 감소 된 단백질, 9 – 겔상 LCP 샘플들을 처리 할 수있는 특별한 주입기 (LCP의 microextrusion 인젝터) 6 loying 우리는 성공적 LCP 매트릭스에서 성장 여러 인간의 GPCR의 미세 전달 및 고해상도 구조 (6)를 수득 세트 당 0.3 미만 mg의 소비. 인젝터는 최대 20, 40 또는 100 크리스탈 함유 LCP ㎕의 샘플이 (10000까지 고압의인가에 의해 압출되는 좁은 모세관 (직경 10 ~ 50 μm의)을 보유 할 수있는 저장 이루어져 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피) 펌프로부터의 액체에 의해 구동되는 압력 증폭 스테이지 유압 플런저로부터 PSI). 모세관 노즐을 빠져 LCP의 스트림이 반응성 가스 (통상, 헬륨 또는 질소)를 평행 흐름에 의해 안정화된다.
여기에 우리가 준비하고 샘플을 특성화하기 위해 필요한 단계의 시각적 데모를 제공합니다LCP-SFX의 실험. 자세한 내용은 게시 된 프로토콜 (10)에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 SFX 방식을 사용하여 X 선 데이터 수집 LCP이 단백질의 결정 아데노신 2A 수용체 (11) 및 사용 준비된다. 우리의 프로토콜 XFEL과 싱크로트론 소스에 직렬 결정학에 의해 데이터 수집 LCP를 스트리밍 할 수있는 임의의 인젝터와 호환 있지만, 설명을 위해, 우리는 참고 문헌에 기술 된 LCP 인젝터를 사용합니다. LCP 고밀도 미세 생성 6. 최적화 침전 조건은 높은 처리량 프로토콜이 결정화를 진행하기 전에 12,13 스크리닝에 의해 식별되어야한다. 이 프로토콜의 일반적인 흐름도가도 1에 도시되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 LCP 인젝터 표준 LCP-SFX 실험을위한 시료 준비 과정의 일반적인 개요를 제공한다. 미결정 크기에 따라, 우리의 경험을 바탕으로, 전체 데이터 세트를 수집하는데 필요한 최종 미결정 함유 LCP 샘플의 총량은 전형적으로 50 내지 100 μL (초기 단백질 함유 LCP 샘플 25-50 μL 표 1)은 품질 및 밀도. 각 100 μL 기밀 유리 주사기 적절한 상기 LCP에 침전제 용액에도 확산을 위해 완전히 연장 된 문자열 형태의 LCP의 약 7 μl를 수용 할 수 있기 때문에, 주사기 적어도 4-7 시료를 준비해야 각 LCP-SFX 실험.
샘플을 직경 모세관 좁은 20-50 μm의 통해 압출되기 때문에, 시료의 이물질 미립자 물질을 피하기 위해 중요하다. 가끔 LCP에 도입 될 수있는 먼지 및 섬유샘플 또는 침전제 용액 인젝터 모세관 폐색 및 실험 중에 중단 시간을 증가시킬 수있다. 따라서, 샘플을 준비하기 전에 5㎛의 기공 필터를 통해 모든 지질 용액을 필터링하는 것이 중요하다. 선택적으로, 청정실 또는 청정실 휴대용 후드 샘플 제조에 사용될 수있다.
이러한 프로토콜은 MP의 결정화를위한 호스트로서 지질 9.9 MAG (모노 올레)를 사용에 기초한다. 그러나 이들은 9.9 MAG에 한정되지 않고 쉽게 고려 지질 상 거동의 차이를 복용 후 다른 LCP 호스트 지질 또는 지질의 혼합물로 구성 될 수있다. LCP 결정화 의원의 구조의 대부분은 9.9 MAG 15 지금까지 가장 성공적인 대표되는 더불어 멕스 중 하나를 사용하여 얻어졌다. SFX 9.9 MAG 사용의 주요 단점은 데이터 수집 진공에서 수행 될 때 종종 발생하는 18 ° C,보다 냉각시 라멜라 결정상으로의 전이이다. titrati7.9 MAG이 프로토콜의 제 5 절에 기술과에이 문제에 대한 좋은 솔루션을 제공합니다. 우리의 경험에 의하면, 결정은 부작용없이 같은 적정을 견딜. 그러나 7.9 MAG 또는 다른 짧은 체인 MAG의 첨가는 바람직하지 않은 경우, 적정 9.9 MAG로 수행 될 수있다. 이 경우, 진공 상태로 주입하는 동안 LCP의 흐름을 안정화 가스는 덜 안정 샘플 흐름을 갖는 희생 대부분의 샘플에서 결정 지질상의 형성을 방지 할 수있는, 질소, 헬륨로 전환되어야한다.
이 현대 XFEL 및 싱크로트론 소스에 직렬 결정학 데이터 수집에 적합한 넓은 범위에 걸쳐 결정의 유량을 조정할 수 있기 때문에 LCP의 겔형 일관성은 결정 담체 매질로서 사용하기 위해 큰 장점을 갖는다. (C)의 크기 순서에 의해 결정 소비 극적인 감소에 XFEL 펄스 반복율 결과 결정 유량 매칭액체 주입 ompared. LCP는 또한 가용성 단백질 (21)의 결정을 위해, 단지 그것이 성장 MP 결정의 전달을위한 적합한 담체 매체이다. 직렬 결정학 실험을 수행하기위한 도구와 시약의 무기고를 확장, 24 – 여러 대안 점성 결정 캐리어 미디어는 최근 22 도입되었다. 또한, 액정 전달 매체로서 LCP 직렬 결정학 적어도 잘 회절 결정 (24, 25)에 대해, 종래의 싱크로트론 소스에서 입증되었다. 검출기 기술에 대한 X 선 크기의 주문에 의해 강도뿐만 아니라 개선을 향상 싱크로트론 소스의 미래 업그레이드, 일련 결정학 구조 결정에 더욱 접근 가능하고 매력적인 방법을 만들 것입니다.
LCP-SFX는 MP 구조 결정에 대한 효능을 입증했다. 여기서, L (예 : 된 GPCR 또는 거대 분자 복합체와 같은) 도전 생물학적 시스템의아니라 단지 가능한 옵션 원자 해상도 구조를 해결하는 경우 ARGE 회절 품질 결정이 성장하기 어려운, LCP-SFX는 매력을 제공 할 수있다. 모든 장점과 함께 즉, MP 결정화 및 결정 납품, 저가 단백질 소비, 방사선 손상의 유무, 실내 온도 데이터 수집, 시간이 해결 연구 26, 27의 가능성없이 결정 수확 요구 사항, LCP-의 행렬로 LCP를 사용하여 SFX는 구조 생물학의 미래에 중요한 역할을한다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R01 GM108635 및 U54 GM094618, 메이요 클리닉 – ASU 공동 씨 그랜트 상 및 NSF STC 수상 1231306.는 우리는 원고 준비에 도움 A. 워커 감사 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여 지원되었다.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
Referencias
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