إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
بروتينات غشاء (النواب) هي المكونات الأساسية لأغشية الخلوية والأهداف المخدرات الأولية. تصميم الرشيد للأدوية تعتمد على المعلومات الهيكلية الدقيقة، التي تم الحصول عليها عادة من قبل البلورات. لكن النواب من الصعب بلورة. وقد استفاد التقدم الذي أحرز مؤخرا في تقرير النائب الهيكلي كثيرا من تطوير أساليب شحمي المرحلة مكعب (نظام الإجراءات الجزائية) التبلور، والتي تسفر عادة الانعراج جيدا، ولكن البلورات غالبا ما تكون صغيرة التي تعاني من أضرار الإشعاع أثناء جمع البيانات البلورات التقليدي في مصادر السنكروترون. وقد مكن تطوير مصادر التي تنتج نبضات الفيمتو ثانية مشرق للغاية الجيل الجديد من أشعة ليزر الإلكترون الحر (XFEL) غرفة جمع البيانات درجة الحرارة من microcrystals مع عدم وجود أو أضرار الإشعاع يكاد يذكر. وقد أسفرت جهودنا الأخيرة في الجمع بين التكنولوجيا نظام الإجراءات الجزائية مع البلورات الفيمتو ثانية مسلسل (نظام الإجراءات الجزائية-SFX) في هياكل عالية الدقة من عدة G مستقبلات البروتين يقترن الإنسان، ثهيك تمثل هدفا بالغ الصعوبة لتحديد هيكل. في تقنية نظام الإجراءات الجزائية، SFX، يتم تجنيده نظام الإجراءات الجزائية في شكل مصفوفة لكل من النمو وتقديم microcrystals النائب إلى تقاطع مجرى حاقن مع شعاع XFEL لجمع البيانات البلورات. وقد ثبت أن نظام الإجراءات الجزائية-SFX يمكن أن تحسن بشكل كبير من قرار الحيود عندما تكون فقط 10 جنوب ميكرون بلورات المتاحة، أو عندما لا يمكن للاستخدام بلورات صغيرة في درجة حرارة الغرفة التغلب على مختلف المشاكل المرتبطة بلورات cryocooled أكبر، مثل تراكم العيوب، mosaicity عالية والتحف cryocooling. يجب التقدم في المستقبل في مصادر الأشعة السينية والتكنولوجيات كاشف جعل البلورات مسلسل جذابة للغاية وعملي للتنفيذ وليس فقط في XFELs، ولكن أيضا في beamlines السنكروترون أكثر يسرا. هنا نقدم بروتوكولات البصرية التفصيلية لإعداد وتوصيف وتسليم microcrystals في نظام الإجراءات الجزائية للتجارب البلورات التسلسلية.وتشمل هذه البروتوكولات طرق لإجراء التجارب تبلور في الحقن وكشف وتميز العينات وضوح الشمس، وتحسين كثافة وضوح الشمس، وتحميل بلورة مكروية نظام الإجراءات الجزائية لادن في الجهاز حاقن وتقديم نموذج لشعاع لجمع البيانات.
Introduction
الأشعة السينية البلورات هي الأسلوب الأكثر نجاحا حتى الآن عن حل هياكل ذرية قرار من بروتينات الغشاء (النواب). تبلور من mesophases شحمي، المعروف أيضا باسم مرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية)، أو في بلورة المتوسط، تمثل واحدة من أهم التطورات في علم البلورات النائب الذي مكن تحديد هيكل عالية الدقة من الأهداف الصعبة مثل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs ) 1. جعلت التطورات الأخيرة في الأدوات والتقنيات نظام الإجراءات الجزائية هذه التقنية المتاحة لمجتمع كبير من علماء الأحياء الهيكلية في جميع أنحاء العالم 2. ومع ذلك، في كثير من الحالات بلورات النائب التي تشكل في نظام الإجراءات الجزائية هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن استخدامها حتى في أكثرها تقدما beamlines microfocus السنكروترون، حيث تعاني عينات من أضرار الإشعاع الشديد وتدهور قبل إشارة كافية بدقة عالية يمكن الحصول عليها 3.
نهج جديد لجمع بيانات البلوراتتم تمكين مع بدء تشغيل أول أشعة ليزر الإلكترون الحر (XFEL). وتستند هذه الطريقة على مبدأ "حيود قبل تدميرها"، لأول مرة نظريا 4 ثم أكدت التجربة على عينات بيولوجية في Linac المتماسك مصدر الضوء (LCLS) 3، الشركة الرائدة في العالم في XFELs الصعب. وXFEL يولد عالية السطوع نبضات الأشعة السينية في بضع عشرات من مدة الفيمتو ثانية التي حيد الضوء من الكريستال البكر قبل ذرات البروتين يمكن ان تتحرك استجابة لأضرار الإشعاع. في التجارب الأولية، التي تم توفيرها microcrystals باستمرار إلى التقاطع مع شعاع XFEL في تيار مائي تنتجها حاقن السائل 5. ويعرف هذا الإعداد التجريبية كما البلورات الفيمتو ثانية مسلسل (SFX). العيب الرئيسي لاستخدام الحقن سائل لSFX هو نسبتهم تدفق عالية، الأمر الذي يتطلب بالتالي عشرات إلى مئات من ملليغرام من البروتين النقي لجمع مجموعة بيانات كاملة. من خلال خطة الإدارة البيئيةloying حاقن خاص التي يمكن التعامل مع العينات نظام الإجراءات الجزائية تشبه الهلام (نظام الإجراءات الجزائية microextrusion حاقن) 6، سلمنا بنجاح microcrystals عدة GPCRs البشرية المختلفة التي تزرع في مصفوفة الإجراءات الجزائية والتي تم الحصول عليها هياكل عالية الدقة من 6-9، مع انخفاض كبير في البروتين الاستهلاك إلى أقل من 0.3 ملغ لكل مجموعة البيانات. يتكون حاقن من خزان التي يمكن أن تعقد ما يصل إلى 20 أو 40 أو 100 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية وضوح الشمس لادن والشعرية الضيق (10-50 ميكرون في القطر) التي يتم من خلالها مقذوف العينة من خلال تطبيق الضغط العالي (تصل إلى 10،000 رطل) من المكبس الهيدروليكي مع مرحلة الضغط تضخيمها، يقودها السائل من مضخة HPLC (عالية الأداء اللوني السائل). استقر تيار من نظام الإجراءات الجزائية التي تخرج من فوهة الشعرية تدفق مواز للغاز متأخرا (عادة الهليوم أو النيتروجين).
هنا نقدم المظاهرات البصرية من الخطوات اللازمة لإعداد وتوصيف العيناتلتجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في البروتوكولات نشرت 10. وكمثال على ذلك، سوف نستخدم الأدينوزين متلقي 2A 11 و تحضير بلورات من هذا البروتين في نظام الإجراءات الجزائية لجمع بيانات الأشعة السينية باستخدام نهج SFX. في حين بروتوكولات لدينا هي متوافقة مع أي حاقن قادر على الجري نظام الإجراءات الجزائية لجمع البيانات عن طريق البلورات التسلسلية في مصادر XFEL والسنكروترون، لأغراض التوضيح، سوف نستخدم حاقن نظام الإجراءات الجزائية وصفها في المرجع. 6. شروط مرسب الأمثل التي تنتج microcrystals ذات الكثافة السكانية العالية في نظام الإجراءات الجزائية يجب أن تحددها الإنتاجية العالية تبلور فحص 12،13 قبل الشروع في هذا البروتوكول. ويرد مخطط نموذجي لهذا البروتوكول في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات وصفها هنا توفر المخطط العام للإجراءات إعداد عينة لتجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX القياسية مع حاقن نظام الإجراءات الجزائية. استنادا إلى تجربتنا، فإن المبلغ الإجمالي للبلورة مكروية محملة نظام الإجراءات الجزائية العينة النهائية اللازمة لتحصيل البيانات الكاملة عادة 50-100 ميكرولتر (الجدول 1؛ 25-50 ميكرولتر من البروتين لادن عينة نظام الإجراءات الجزائية الأولية)، وهذا يتوقف على حجم بلورة مكروية والجودة والكثافة. وبما أن كل 100 ميكرولتر حقنة زجاجية مانعة لتسرب الغاز يمكن أن تستوعب حوالي 7 ميكرولتر من نظام الإجراءات الجزائية في شكل سلسلة ممتدة بشكل كامل لضمان حسن وحتى نشر الحل مرسب في نظام الإجراءات الجزائية، ما لا يقل عن 4-7 عينات في الحقن يجب أن تكون على استعداد ل كل تجربة نظام الإجراءات الجزائية-SFX.
منذ مقذوف العينة من خلال ضيق 20-50 ميكرون في القطر الشعرية، لا بد من تجنب أي مواد الجسيمات الأجنبية في العينة. الغبار والألياف التي يمكن إدخالها في بعض الأحيان في نظام الإجراءات الجزائيةعينة أو مرسب الحلول قد يعوق الشعرية حاقن ويزيد من الوقت لأسفل أثناء التجربة. وبالتالي، فمن المهم لتصفية الدهون وجميع الحلول من خلال مرشح المسام 5 ميكرون قبل إعداد العينات. اختياريا، غرفة نظيفة أو محمول غطاء غرفة نظيفة يمكن استخدامها لإعداد العينات.
وتقوم هذه البروتوكولات على استخدام 9.9 MAG (monoolein) كما الدهون المضيفة للالنائب التبلور. أنها، مع ذلك، لا تقتصر على 9.9 MAG ويمكن أن تتكيف بسهولة مع أي الدهون المضيف نظام الإجراءات الجزائية الأخرى أو خليط من الدهون بعد الأخذ في الاعتبار الاختلافات في السلوك المرحلة الدهون. معظم هياكل النواب تبلورت في نظام الإجراءات الجزائية التي تم الحصول عليها باستخدام واحدة من أكواب، مع 9.9 MAG يجري الممثل الأكثر نجاحا حتى الآن 15. العيب الرئيسي لاستخدام 9.9 MAG لSFX هو انتقالها إلى مرحلة الكريستال رقائقي على التبريد أقل من 18 درجة مئوية، والذي يحدث في كثير من الأحيان عندما يتم تنفيذ الحصول على البيانات في فراغ. وtitratiعلى 7.9 MAG وصفها في المادة 5 من هذا البروتوكول يوفر حلا جيدا لهذه المشكلة. في تجربتنا، بلورات الصمود مثل هذا المعايرة دون أي آثار سلبية. إذا، ومع ذلك، فإن إضافة 7.9 MAG أو MAG بالسلاسل القصير آخر غير مرغوب فيه، ومعايرة لا يمكن أن يؤديها مع 9.9 MAG. في هذه الحالة، والغاز أدى إلى استقرار تدفق نظام الإجراءات الجزائية خلال الحقن في الفراغ يجب أن تنتقل من الهيليوم إلى النيتروجين، والتي يمكن أن تمنع تشكيل المرحلة الدهون البلورية في معظم العينات، على حساب وجود تدفق العينة أقل استقرارا.
اتساق هلامية من نظام الإجراءات الجزائية لديه ميزة كبيرة لاستخدامها كوسيلة الكريستال الناقل، لأنه يسمح تعديل معدل التدفق الكريستال عبر طائفة واسعة، ومناسبة لجمع البيانات البلورات التسلسلية في مصادر XFEL والسنكروترون الحديثة. مطابقة معدل التدفق وضوح الشمس مع نبض XFEL النتائج نسبة الرسوب في خفض كبير في استهلاك وضوح الشمس من حيث الحجم جompared لحقن السائل. نظام الإجراءات الجزائية هو وسيلة الناقل مناسبة لتسليم ليس فقط من بلورات النائب نمت في ذلك، ولكن أيضا لبلورات من البروتينات القابلة للذوبان 21. وقد تم مؤخرا إدخال العديد من وسائل الإعلام وضوح الشمس الناقل لزجة بديلة 22-24، وتوسيع ترسانة من الأدوات والكواشف لإجراء التجارب البلورات التسلسلية. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت البلورات التسلسلية مع نظام الإجراءات الجزائية كوسيلة تسليم وضوح الشمس في مصادر السنكروترون التقليدية، على الأقل بالنسبة لبلورات الانعراج جيدا 24،25. وترقيات في المستقبل من مصادر السنكروترون التي تعزز الأشعة السينية كثافة من حيث الحجم، فضلا عن إدخال تحسينات في مجال التكنولوجيات كاشف، وجعل البلورات التسلسلية وسيلة أكثر سهولة وجاذبية للتصميم هيكل.
وقد أثبت نظام الإجراءات الجزائية-SFX فعاليته عن النائب تقرير الهيكلي. لالنظم البيولوجية الصعبة (مثل GPCRs أو مجمعات الجزيئات) حيث لالدو، بلورات ذات جودة الحيود من الصعب أن ينمو، قد نظام الإجراءات الجزائية-SFX تقديم جذابة، إن لم يكن، والخيار الوحيد القابل للتطبيق لحل هيكل قرار الذري. مع كل مزاياها، أي باستخدام نظام الإجراءات الجزائية بمثابة النموذج لبلورة النائب والتسليم وضوح الشمس، وانخفاض استهلاك البروتين، وعدم وجود أضرار الإشعاع، درجة حرارة الغرفة جمع البيانات، وإمكانيات الدراسات وقت حل 26،27 وأي شرط الحصاد وضوح الشمس، LCP- يجب SFX لعب دورا هاما في مستقبل البيولوجيا البنيوية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 GM108635 وU54 GM094618، جائزة منحة مايو كلينيك-جامعة ولاية أريزونا التعاوني البذور وجبهة الخلاص الوطني STC جائزة 1231306. نشكر A. وكر للمساعدة في إعداد المخطوط.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
Referencias
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid?. Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
