Трансплантация в коврик для мыши Овариальное Fat

Вся работа в естественных условиях описано одобрено Институциональным уходу и использованию животных комитетом Корнельского университета по. 1. Примеры Подготовка к Овариальных жировое Assays Выделение и культуры первичных Трубное эпителием (TE) Клетки Эвтаназии донора от 6 до 8-недельного девственник β-актин-усиленный зеленый флуоресцентный белок (EFGP) или бета-актин-Discosoma красный флуоресцентный белок (DsRed) у мышей с помощью СО 2 введение с последующей цервикальной дислокацией. Проверка успешной эвтаназию с помощью пальца щепоткой. Поместите индивидуальную мышь на фильтровальную драпировки, вентральной стороной вверх, а затем протрите живот с 70% этанола. Откройте кожу, делая боковой разрез по срединной линии тела и кончики пальцев подтягивает кожу выше и ниже разреза в направлении головы и хвоста мыши. Удерживая брюшины с помощью тупых пинцетом и сделать разрез с тонкими ножницами, чтобы открыть полость тела. Аккуратно надавите на катушку intestinе в сторону и найти репродуктивных органов. С тонким пинцетом подобрать один рог матки и разрезают на 0,5 см выше точки, где рога матки разделиться. Удерживая рог матки, отсечь соединительную ткань, прикрепленную к роге матки, маточной трубы, яичника и жировой ткани яичников. Поместите расчлененный ИРТ в чашке с 6 мл стерильного фосфатно-солевом буферном (PBS). Продолжайте второй репродуктивный тракт. Передача блюдо в шкафу биологической безопасности и мыть тканей 3 раза в 6 мл стерильной PBS. Продолжить работу под рассечение микроскопом, расположенный в шкафу биологической безопасности. Захватите рога матки с мелкими пинцетом и отсоедините рога матки от маточной трубы путем разъединять на маточно-трубное перехода. Вырежьте бурсу яичника, окружающий завязь с помощью иглы 25 G. Примечание: После того, как бурса овариальный был удален, рассечение завершена и индивидуальная маточной трубы остается в растворе PBS. Передача оде маточной трубы в капле 50 мкл PBS до 3,5 см чашку и фарша в 0,1 мм с использованием 28 штук калибра иглы. Передача 200 мкл сбраживания буфера 1 (модифицированной среде Игла (DMEM) F12 орла Дульбекко () среда Хэма , дополненной 300 единиц мл -1 коллагеназы и 100 единиц мл -1 гиалуронидазы) и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С в 5% СО в 2 инкубатора. После инкубации добавляют 1 мл 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и приостановить решение с помощью кончика пипетки 1 мл (он же синий TIP) в 20 раз в течение 3 минут. Добавляют 5 мл + 4 ° C DMEM / F12 (Хэма), содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки. Сбор тканей путем центрифугирования (600 RCF, 5 мин, при комнатной температуре (RT)), и добавляют 1 мл пищеварении буфера 2 (DMEM F12 () среда Хэма с добавлением 7 мг мл -1 диспаза II и 10 мкг мл -1 дизоксирибонуклеаза I ( ДНКазы I)). Приостановка ткани на пеллетах 20 раз с помощью пипетки 1 мл тип. Добавьте 5 мл сыворотки бесплатно полную среду для роста мыши маточных эпителий (M-TE-GM, таблица 1). Сбор клеток путем центрифугирования (600 RCF, 5 мин, RT). Добавляют 1 мл M-TE-GM, приостанавливать и подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Семенной 1 х 10 5 клеток в 1 мл на лунку в плите 24-луночного низким крепежного и инкубировать в М-TE-GM при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 4 дней. Изменение среды каждый день. Подготовка одноклеточных суспензий культивируемых первичных суспензионных TE клеток из бета-актина-EGFP или β-актин-DsRed мышей. Собирают TE суспензионных культур из 24-луночного низких пластин крепления. Центрифуга (600 RCF, 5 минут, комнатная температура), и подвесить гранулы кювета с 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА. Инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Прекратить активность трипсина путем добавления 5 мл DMEM / F12 (Хэма), содержащей 5% сыворотки плода коровы. Сбор Клеточный осадок центрифугированием (600 RCF, 5 минут, комнатная температура). Промыть Клеточные осадки дважды с 4 мл холодного PBS (4 ° С), добавляют 1 мл PBS в осадок клеток, и приостанавливать. Граф клеток с помощью гемоцитометра и переносят 1,7 мл центрифужные пробирки. Работая на льду, добавляют 1 × 10 5 клеток в 10 мкл PBS, затем добавляют 10 мкл базальной мембраны матрицу. Приостановка и транспортировать на льду к животному комнате. Примечание: Выполните все рассечение и тканевой культуры работы в кабинете биологической безопасности в стерильных условиях. Получение увековечена линия клеток человека Отдельно растут лентивирусов-EGFP и -mCherry маркированы человек увековечен поверхность яичника эпителий клеток lineHIO118 до 80 – 90% сплошности на 10 см чашки при температуре 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе. Мыть посуду в два раза с 10 мл PBS, добавляют 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА на чашку и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Остановить реакцию добавлением 10 мл DMEM / F12 (Хэма), содержащей 5% сыворотки плода коровы. собиратьКлеточный осадок центрифугированием (600 RCF, 5 минут, комнатная температура). Промыть Клеточные осадки дважды 10 мл холодного PBS (4 ° С), добавляют 1 мл PBS в осадок клеток, и приостанавливать. Граф клеток с помощью гемоцитометра и переносят 1,7 мл центрифужные пробирки. Работая на льду, добавить 1,0 х 10 6 Ленти-mCherry меченые клетки + 1,0 × 10 6 Ленти-EGFP меченых клеток до 10 мкл PBS. Добавьте 10 мкл базальной мембраны матрицы. Приостановка и транспортировать на льду к животному комнате. Приготовление маточной трубы Проанализируйте отдельные маточные трубы от 6 до 8-недельных мышей целинных β-актин-DsRed в PBS, как описано в пунктах 1.1.1-1.1.5. Передача отдельных трубок матки в каплю 200 мкл PBS под микроскопом рассечение. Осторожно размотать маточные трубы с помощью пинцета и 28 калибровочных игл путем удаления mesosalpinx, часть широкой связки, которая поддерживает сегменты маточной трубы. Поместите одиночные развернутого трубы матки в капле 200 мкл не ледяным PBS до овариальный жировой ткани реципиента подвергается и готова получить пересадку. 2. Овариальное Fat Pad Трансплантация Примечание: Лечить инструменты между каждой операцией животных. Подготовить и организовать все оборудование заранее. Спинные трансплантаций к правой яичников жировой ткани являются льготное, так как это позволяет избежать селезенку. Однако получатели могут иметь трансплантаты в обоих яичниках жировым. Используйте сингенных мышей или тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID / NCr) мышей в качестве получателей первичных клеток. Для человеческих клеток, таких как клетки HIO118, использование Nod / SCID / гамма мышей (NSG) или SCID мышей. Обезболить мышь адресата одной внутрибрюшинной инъекции 2,2,2-Tribromoethanol в дозе 0,15 мл / 10 г массы тела. Место животное на грелку, в животном капюшоном и подтвердить надлежащее обезболивание потерей педали рефлекса (носок щепотку). Нанесите мазь ветеринара на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время какживотное находится под анестезией. Вводят животным подкожно обезболивающего Кетопрофен в дозе 4 мг / г массы тела для лечения для послеоперационной боли. Примечание: В качестве альтернативы, использовать изофлуран для анестезии. Место животное в индукционной камере и регулировать расходомер кислорода в 0,8-1,5 л / мин и изофлурановым испарителем до 2-3%. Удалите наркозом животного из камеры, пусть дышат изофлуран от маски и установите расходомер кислорода в 0,4-0,8 л / мин и изофлурановым испарителем до 1,5%, а затем начать операцию. Бритье хирургическую область с # 40 машинки для стрижки; удалить волосы из зоны 2 раза хирургической области, подготовить бритую кожу с тремя антисептических скрабы повидон-йодом, а затем на 70% этанола, и накрыть стерильной драпировки. Переместить животное под микроскопом рассечение, расположенного в шкафу биологической безопасности. Выставляют репродуктивного тракта с помощью разреза в дорсомедиальной положении непосредственно над яичников жировой ткани. Примечание: Critскую шаг: Точная Разрез кожи облегчает заживление ран, использование скальпелем рекомендуется на этапе 2.4. Тупыми тонким пинцетом вытащить овариальный жировой ткани тщательно через разрез по направлению к средней линии, сводя к минимуму повреждения нервов и крупных кровеносных сосудов. Важнейший шаг: Если происходит кровотечение, остановить операцию и рассмотреть вопрос пересадки на другой животного-хозяина. Под контролем рассечение микроскопом с помощью 28 калибра скошенной иглой сделать 2-4 мм глубокий надрез в жировой ткани яичников, 3-4 мм над яичником. Критический шаг: Убедитесь в том, что разрез проходит только через половину жировой ткани; прокалывание весь путь до конца к нижней стороне вызывает утечку. Будь скор и без промедления приступить после этого шага. Для клеточных трансплантаций, заполнить шприц (30 калибр иглы) с 10-20 мкл клеток базальной мембраны матрицы-смеси и вводят в жировой разрез площадки. Для пересадки маточной трубы, подобрать остроумие маточной трубыч тонким пинцетом и место в 10 – 20 мкл матрицы базальной мембраны держали на льду. Использование 0.1-10 / 20 мкл XL закончил кончик фильтра (укороченный на 3 мм) подобрать ткани и базальной мембраны матрицы суспензии и выпустить в разрез жировой ткани. Подождите 5 минут мембраны матрица фундамента затвердеть и место репродуктивного тракта обратно в брюшину. Закройте мышцы с 2 stiches хирургического шовного материала и кожи с двумя маленькими раневых скрепками или хирургического шовного материала. Повторите шаги 2.4-2.8 трансплантировать PBS-базальной мембраны матрица-смесь в контра-латеральной жировое животного, который будет служить в качестве контроля. Критический шаг: После операции поместить животное на грелку, потому что потеря тепла происходит быстро под наркозом мышей. Пусть животное восстановиться на грелку в родной клетке и не наблюдать за животное, пока полностью проснулся от наркоза. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания Sternaл отдохновение. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел. Поместите несколько предварительно влажных пищевых гранул внутри клетки в дополнение к сухой пищи на клетке после операции. Применяют послеоперационные анальгетиков, если это необходимо в течение следующих нескольких дней и осмотреть рану ежедневно. Применяют антибиотики в соответствии с утвержденным протоколом животных в случае возникновения раневой инфекции. Удалить рану клипы через 10 дней после операции, когда рана полностью закрыта. 3. гистологии и Image Acquisition Привитые Сбор и сохранение Готовят 4% раствор параформальдегида путем смешивания 26 мл DDH 2 O 4 мл 10х PBS и 10 мл 16% -ного раствора параформальдегида. Рассеките в одном блоке, насаждаемое овариальный жировой ткани, яичника, маточной трубы, 0,5 см матки, как описано в шагах 1.1.1-1.1.4. Сразу же место в 2 мл 4% параформальдегида и зафиксировать в течение 2 часов, при комнатной температуре. Из того же животного, рассекают не-приживлениеконтралатеральной яичника система жировой ткани трансплантировали PBS-базальной мембраны матричной смеси в качестве контроля (см шаг 2.9). Закрепить и процесс таким же образом. После фиксации стирке тканей три раза PBS в течение 5 мин и инкубировать в течение ночи в PBS при 4 ° С. Для всего монтажа визуализации яичников жировой ткани переходите к шагу 3.2.1. Примечание: После того, как ткани захвата изображений могут быть заморожены (3.3.1) или обработанные для парафин (3.3.2). Инкубацию в течение ночи в 30% сахарозы в PBS при 4 ° С улучшает качество замороженных тканей. Image Acquisition Бесплатно разместить весь монтажа яичниковые системы жировое в PBS заполненных блюд и изображения с помощью инвертированного микроскопа, оборудованного с приложением эпи-флюоресценции и цветной камерой высокой четкости, с 4-мя, 10x целями и стереомикроскопа оснащены насадкой флюоресценции, цветной камерой и плана Апо 1xWD70, цели ED план 1.5xWD45. гистология Следующийполучение изображений в целом монтажа (3.2.1) поместите каплю 200-500 мкл вложение среды для образцов замороженной ткани на 2 х 1 см кусок лабораторной пленкой и с помощью пинцета, перенести ткань капли. Возьмите фильм на одном краю и передачи ткани среднего каплю к криогенной мл флакон 1,8. Закройте флакон и погрузить в жидкий азот. Хранить замороженные ткани при -80 ° С. В качестве альтернативы, действуйте со стандартным парафин. Используйте 20-40 объемы объема ткани для каждого шага. Погружают ткань один раз в 65% этаноле в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. Погружают ткань один раз в 70% этаноле в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. На этом этапе образцы могут храниться в течение нескольких месяцев при комнатной температуре. Погружают ткань один раз в 90% этаноле в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. Погружают ткань один раз в 95% этаноле в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. Погружают ткань в два раза в абсолютном этаноле (200 доказательства) в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. <литий> погружают ткани дважды в хлороформе в течение 30 мин, встряхивая осторожно при комнатной температуре. Погружают ткань один раз в парафин в течение 30 мин, встряхивая осторожно при 58 ° C. Погрузитесь ткани один раз в парафин в течение 12 часов, встряхивая осторожно при 58 ° C. Погружают ткань один раз в парафин в течение 3 ч, при 58 ° C. Поместите ткани в гистологических форм металлических и заполнить формы с 58 ° C парафин. Добавить пластиковую гистологии кассеты поверх парафина и остывать парафина до + 4 ° С. Извлечь блок парафином ткани и хранить при комнатной температуре. Примечание: температура Парафин не должна превышать 58 ° C для оптимального сохранения ткани, пригодной для иммуногистохимического окрашивания. В качестве альтернативы, Подготовка к парафин с образцами обработки геля. Аспирируйте PBS и передавать все-монтирование ткани до 70% этанола. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. В водяной бане нагрейте образец обработки геля до 60 ° С. Pipettе 200 мкл геля для обработки образца на лабораторном пленочной подкладке Петри. Использование тонких щипцов рассечение передать всю систему для монтажа в ткани до капли геля обработки образца. Дайте образец гель обработки вилка для отверждения при комнатной температуре, или затвердевать пробку в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Поместите гель обработки образца встроенной ткани в кассетах ткани гистологии, зажатых между пенопластовых биопсии подушечками. Вставить в парафин, как на этапах 3.3.2-3.3.2.10. Примечание: Образец обработки геля вложение предотвращает потерю и позволяет сохранение небольших образцов хрупких тканей. Примечание: Тканей сохраняются при замораживании или парафин подходят для иммуногистохимического окрашивания 14,15.