マウスの卵巣脂肪パッドに移植

記載されている全てのin vivoでの作業は、コーネル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 卵巣の脂肪パッドのアッセイのための1.サンプルの準備プライマリ卵管上皮の単離および培養（TE）細胞 COにより8週齢の処女βアクチン強化緑色蛍光タンパク質（EFGP）またはβアクチンディスコソマ赤色蛍光タンパク質（DsRedの）マウスに頸椎脱臼に続いて2投与を供与6-安楽死させます。つま先のピンチによって成功した安楽死を確認します。 吸収性ドレープの個々のマウスを置き、腹側を上にしてから、70％エタノールで腹部を拭いてください。身体正中線で横切開を行うことで、指先がマウスの頭部と尾​​部に向かって切開部の上下に皮膚を引っ張ると皮膚を開きます。 鈍ピンセットを用いて腹膜を持ち、体腔を開くために細かいハサミでカットしてください。ゆっくりintestinのコイルをプッシュ脇電子と生殖器官を見つけます。 細かい鉗子で1子宮角をピックアップし、子宮角が分離点以上0.5cmにカット。子宮角を保持しながら、子宮角、卵管、卵巣および卵巣の脂肪パッドに取り付けられた結合組織を離れて解剖。 6ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で皿に解剖生殖器官を置きます。第二の生殖器官に進みます。 バイオセーフティキャビネットに皿を移し、6ミリリットル滅菌PBSで組織を3回洗浄します。バイオセーフティキャビネットにある解剖顕微鏡下での作業を続行します。細かいピンセットで子宮角をつかみ、子宮卵管接合部で切断することによって卵管から子宮角を切断します。 25 G針を使用して卵巣を囲む卵嚢を切り取ります。 注：卵巣嚢を除去した後、切開が完了すると、個々の卵管にPBS溶液中に残ります。 SINGLを転送3.5センチメートル皿にPBSの50μlのドロップでの電子の卵管と28ゲージの針を使用して、0.1ミリメートル片にミンチ。 200μlの消化緩衝液1（ダルベッコ改変イーグル培地300ユニットml -1のコラゲナーゼおよび100ユニットml -1のヒアルロニダーゼを補った（DMEM）F12（ハム）培地）に移し、5％CO中で37℃で1時間インキュベート2インキュベータ。 インキュベーション後に1mlのを0.25％トリプシン – エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、3分間、1mLのピペットチップ（別名ブルーチップ）の助けを借りて20倍溶液を中断する。 （ハム）培地は、2％ウシ胎児血清を含む5ミリリットル+ 4°C DMEM / F12を追加します。 （（ハム）媒体は7ミリグラムml -1のディスパーゼIIおよび10μgml -1のデオキシリボヌクレアーゼIを補充し、遠心分離（600 RCF、5分間、室温（RT））、によって組織を収集し、1ミリリットルの消化緩衝液2（DMEM F12キーを追加します。 DNアーゼI））。 1ミリリットルピペットTIの助けを借りて、組織ペレットを20回サスペンドP。 5ミリリットルの無血清完全なマウス卵管上皮成長培地（M-TE-GM、表1）を追加します。 遠心分離（600 RCF、5分、RT）によって細胞を収集します。中断し、血球計数器により細胞をカウントし、1ミリリットルM-TE-GMを追加します。シード1×10 5 24ウェル低接着プレートでウェルあたり1ミリリットル中の細胞と4日間、5％CO 2インキュベーター中37℃でM-TE-GMでインキュベートします。 毎日培地を変更します。 βアクチン-EGFPまたはβアクチンのDsRedマウスから培養された一次懸濁液TE細胞の単一細胞懸濁液を準備します。 24ウェル低接着プレートからTE懸濁培養物を収集します。遠心分離（600 RCF、5分、RT）、そして1mlの0.25％トリプシン-EDTAで細胞ペレットを懸濁します。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で10分間インキュベートします。 5％ウシ胎児血清を含む（ハム）培地を5ミリリットルのDMEM / F12を追加することにより、トリプシン活性を停止します。遠心分離（600 RCF、5分、RT）によって細胞ペレットを収集します。 洗浄細胞ペレットを冷PBSで2回（4°C）の4ミリリットルで、細胞ペレットあたり1mlのPBSを追加し、一時停止します。血球計数器により細胞をカウントし、1.7ミリリットルの遠心分離管に移します。氷の上で作業し、10μlのPBSに1×10 5個の細胞を追加し、その後、10μlの基底膜マトリックスを追加します。動物室に氷上でサスペンドと輸送。 注意：滅菌条件下でバイオセーフティキャビネット内のすべての解剖および組織培養作業を実行します。 不死化ヒト細胞株の作製別に成長レンチウイルス-EGFPと-mCherry標識ヒト不死化卵巣表面上皮細胞lineHIO118は80時まで- 5％CO 2インキュベーター内で37℃で10センチの皿に90％の密集度。 10 mlのPBSで二回洗浄皿、皿毎に1 mlの0.25％トリプシン-EDTAを添加し、5％CO 2インキュベーター中で37℃で10分間インキュベートします。 10 mlのDMEM / F12 5％ウシ胎児血清を含む（ハム）培地を添加することにより反応を停止させます。収集します遠心分離により細胞ペレット（600 RCF、5分、RT）。 洗浄細胞ペレットを冷PBSで2回（4°C）10mlで、細胞ペレットあたり1mlのPBSを追加し、一時停止します。血球計数器により細胞をカウントし、1.7ミリリットルの遠心分離管に移します。 氷の上で作業し、1.0×10 6レンチ-mCherryを標識細胞+ 1.0×10 6レンチ-EGFPは、10μlのPBSに細胞を標識した追加します。 10μlの基底膜マトリックスを追加します。動物室に氷上でサスペンドと輸送。 卵管の調製 1.1.1-1.1.5の手順で説明するように、6-から、PBS中の8週齢の処女βアクチンのDsRedマウスに個々の子宮管を解剖。解剖顕微鏡下で200μlのPBSのドロップに単一の子宮管を転送します。そっと卵管間膜、卵管のセグメントをサポートする広範な靱帯の部分を除去することにより、ピンセットと28ゲージの針の助けを借りて、子宮管をほどきます。 2のドロップで単一の非コイル状子宮チューブを入れます00μlの氷冷PBS受信者の卵巣の脂肪パッドが露出し、移植を受けるために準備されるまで。 2.卵巣の脂肪パッド移植注：各動物の手術の間に器具を消毒します。事前にすべての機器を準備し、手配。これは脾臓を回避するように、右側の卵巣の脂肪パッドに背移植が優遇されています。ただし、受信者は両方の卵巣の脂肪パッドで移植を有することができます。 初代細胞のレシピエントとして同系マウスまたは重症複合免疫不全（SCID /のNCr）マウスを使用してください。ヒト細胞のようなHIO118細胞、使用NOD / SCID /γ（NSG）マウスまたはSCIDマウスの場合。 0.15ミリリットル/ 10g体重の用量で2,2,2-トリブロモエタノールの単一腹腔内注射でレシピエントマウスを麻酔。動物のフードに、加熱パッド上で動物を置き、ペダル反射（つま先ピンチ）の損失によって適切な麻酔を確認します。しばらく乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。動物は麻酔下です。術後疼痛のために治療するために、4ミリグラム/ g体重の用量で鎮痛剤ケトプロフェンと動物の皮下に注入します。 注：別の方法として、麻酔のためにイソフルランを使用しています。誘導室で動物を置き、0.8から1.5 L /分で2〜3％のイソフルラン気化器に酸素流量計を調整します。チャンバーから麻酔した動物を削除し、それがマスクからイソフルランを呼吸し、手術を開始した後、1.5％に0.4〜0.8リットル/分およびイソフルラン気化器に酸素流量計を設定してみましょう。 ＃40バリカンで手術領域を剃ります。エリアから毛を取り除く2回手術領域、70％エタノールに続いポビドンヨードの3消毒スクラブで剃毛した皮膚を準備し、滅菌ドレープでカバー。 バイオセーフティキャビネットにある解剖顕微鏡下で動物を移動します。直接卵巣の脂肪パッド上記背内側の位置で切開することにより生殖器官を公開します。 注：クリティカルiCalのステップ：正確な皮膚切開は創傷治癒を促進し、メスの使用は、ステップ2.4​​で推奨されています。 鈍細かい鉗子を使用すると、神経や主要な血管へのダメージを最小限に抑え、正中線に向かって切開によって慎重に卵巣の脂肪パッドを引き出します。 重要なステップ：出血が発生した場合は、手術を中止し、別の宿主動物に移植することを検討してください。 28ゲージベベル針の助けを借りて、解剖顕微鏡の制御下で3〜4ミリメートル卵巣の上に、卵巣の脂肪パッドに2〜4ミリメートルの深い切開を行います。 重要なステップ：切開だけ脂肪パッドの半分を通過していることを確認してください。底面までのすべての方法を穿刺して、漏れが発生します。迅速であることと、この工程の後遅滞なく進行します。 細胞移植のために、細胞基底膜マトリックス混合物の10から20μlのシリンジ（30ゲージの針）を記入し、脂肪パッドの切開部に注入します。卵管移植の場合、卵管のウィットを拾いますH細かい鉗子と10での場所 – 20μlの基底膜マトリックスは、氷上に保持しました。 0.1〜10/20μLをUsing XLは（3ミリメートル短縮）フィルターチップtissueと基底膜マトリックスサスペンションをピックアップし、脂肪パッド切開への放出を卒業し​​ました。 基底膜マトリックスが固化し、バック腹膜への生殖器官を配置するための5分待ちます。 2外科手術用縫合糸のstichesと2小傷クリップまたは縫合糸で皮膚と筋肉を閉じます。 繰り返して、コントロールとなる動物の対側脂肪パッドにPBS-基底膜マトリックス混合物を移植するために2.4から2.8を繰り返します。 重要なステップ：熱損失は、麻酔したマウスで急速であるため、手術後、加熱パッド上に動物を配置します。 動物が本来のケージに加熱パッド上で回復し、麻酔から完全に目を覚ましまで動物を観察してみましょう。それは胸骨を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでくださいリットルの横臥。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 手術後のケージの上に食べ物を乾燥させるだけでなくケージの中にプリウェットフードペレットの一握りを置きます。必要に応じて、次の数日間、術後の鎮痛剤を適用し、毎日の傷を調べます。創傷感染が発生した場合、承認された動物プロトコルに従って抗生物質を適用します。傷が完全に閉じていたときに、10日手術後の創傷クリップを削除します。 3.組織学および画像取得グラフト収集と保存 26ミリリットルのddH 2 Oで4ミリリットル10×PBSおよび10ミリリットル16％パラホルムアルデヒド溶液を混合することにより、4％パラホルムアルデヒド溶液を準備します。 手順で説明するように、1つのブロック、移植した卵巣の脂肪パッド、卵巣、卵管0.5センチ子宮内解剖1.1.1-1.1.4。すぐに2ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド中に入れ、室温で、2時間固定します。同じ動物から、非生着解剖対照としてPBS-基底膜マトリックス混合物を移植した反対側の卵巣の脂肪パッドシステム（ステップ2.9参照）。同じように修正して、プロセス。 固定の洗浄の後5分間、PBSで3回組織し、4℃でPBS中で一晩インキュベートします。 卵巣の脂肪パッドのホールマウントイメージングのために3.2.1に進みます。 注：画像取得組織を凍結（3.3.1）またはパラフィン包埋（3.3.2）のために処理することができた後。 4℃でPBS中30％スクロース中で一晩インキュベートし、凍結組織の品質を改善します。 画像収集落射蛍光アタッチメントおよび高精細カラーカメラ4と、10倍対物レンズ、蛍光取り付け、カラーカメラとプランを備えた実体顕微鏡を備えた倒立顕微鏡を用いてPBS充填皿と、画像内の卵巣の脂肪パッドシステム全体マウント配置アポ1xWD70、EDプラン1.5xWD45目標。 組織学以下ホールマウント画像取得（3.2.1）実験用フィルムの2×1cmの片に凍結組織標本のための媒体を埋め込み、鉗子を使用しての200から500μlのドロップを置き、ドロップに組織を移します。一方の縁でフィルムをピックアップし、1.8ミリリットルの低温バイアルに組織培地ドロップを転送します。バイアルを閉じて、液体窒素に突入。 -80℃で凍結組織を保管してください。 代わりに、標準的なパラフィン包埋を進めます。ステップごとに組織容積の20から40のボリュームを使用してください。 室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度65％エタノールで組織を浸し。 室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度、70％エタノールで組織を浸し。この段階で、サンプルを室温でヶ月間保存することができます。 室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度90％エタノールで組織を浸し。 室温で穏やかに振盪しながら、30分間に一度、95％エタノールで組織を浸し。 室温で穏やかに振盪しながら、30分間無水エタノール（200プルーフ）で二回組織を浸し。 <李>は室温で穏やかに振盪しながら、30分間、クロロホルムで二回組織を浸し。 58℃で穏やかに振盪しながら、30分間パラフィンに一度組織を浸し。 58℃で穏やかに振盪しながら、12時間、パラフィンに一度組織を浸し。 58℃で、3時間、パラフィンに一度組織を浸します。 金属組織学金型内の組織を置き、58℃のパラフィンと金型を埋めます。パラフィンの上にプラスチック製の組織学カセットを追加し、4℃にパラフィンをクールダウン。 RTでパラフィン組織ブロックや店舗を抽出します。 注：パラフィン温度は、免疫組織化学染色に適した組織の最適な保存のために58℃を超えてはなりません。 また、検体処理ジェルとパラフィン包埋のために準備します。 PBSを吸引し、70％エタノールにホールマウント組織を移します。 2時間室温でインキュベートします。水浴中、60℃に予熱検体処理ゲル中。 Pipett実験用フィルムライニングペトリ皿上に検体処理ゲルのE 200μL。細かい解剖鉗子を使用すると、検体処理ゲルドロップにホールマウント組織システムを転送します。 検体処理ゲルプラグは室温で固化、または4℃で10分間のプラグを固化することができます。 生検フォームパッドの間に挟まれた組織学組織カセット内の検体処理ゲル包埋組織を置きます。ステップ3.3.2-3.3.2.10のようにパラフィンに埋め込みます。 注意：試料の処理ゲル埋め込みが損失を防止し、小さな脆弱な組織サンプルの保存を可能にします。 注：凍結またはパラフィン包埋によって保存組織は、免疫組織化学染色14,15に適しています。