Trapianto nel Mouse Pad ovarico Fat

Tutto il lavoro in vivo descritto viene approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Cornell University. 1. Preparativi di esempio per ovariche Fat Pad Assays Isolamento e la coltura di primaria Tubal Epitelio Cells (TE) Euthanize donatore da 6 a 8 settimane di età vergine di β-actina-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) o rosso fluorescente delle proteine ​​(DsRed) topi β-actina Discosoma-by CO 2 amministrazione seguita da dislocazione cervicale. Verificare l'eutanasia di successo da un pizzico dito del piede. Posizionare un mouse individuo su un telo assorbente, ventrale rivolta verso l'alto, e quindi pulire l'addome con il 70% di etanolo. Aprire la pelle facendo una incisione laterale alla linea mediana del corpo e con le dita tirare la pelle sopra e sotto l'incisione verso la testa e la coda del mouse. Tenere il peritoneo con pinze smussato e fare un taglio con le forbici sottili per aprire la cavità del corpo. Spingere delicatamente la bobina del intestindi e da parte e di individuare gli organi riproduttivi. Con una pinza sottile prendere un corno uterino e tagliare 0,5 cm sopra il punto in cui le corna uterine separano. Tenendo premuto il corno uterino, sezionare via il tessuto connettivo attaccato al corno uterino, tuba uterina, cuscinetto adiposo ovaie e alle ovaie. Posizionare tratto riproduttivo sezionato in un piatto con 6 ml sterile tampone fosfato (PBS). Procedere con il secondo tratto riproduttivo. Trasferire il piatto per un armadio biosicurezza e lavare i tessuti per 3 volte in 6 ml di PBS sterile. Continuare il lavoro al microscopio dissezione situato nel cabinet biosicurezza. Afferra il corno uterino con le pinzette sottili e scollegare il corno uterino dal tubo uterino tagliando a livello della giunzione utero-tubarica. Tagliare la borsa ovarica che circonda l'ovaio utilizzando un ago da 25 G. Nota: Dopo la borsa ovarica è stato rimosso, la dissezione è completa e il tubo uterino individuo rimane nella soluzione PBS. Trasferire un single tuba uterina in una goccia 50 ml di PBS per un piatto di 3,5 cm e usa mezzi in pezzi 0,1 mm con 28 aghi di calibro. Trasferimento a 200 buffer di digestione microlitri 1 (modificato (DMEM) F12 Eagle Dulbecco () medio di Ham integrato con 300 unità ml -1 collagenasi, 100 unità ml -1 ialuronidasi) e incubare per 1 ora a 37 ° C in un CO 5% 2 incubatore. Dopo l'incubazione, aggiungere l'acido tripsina-Ethylenediaminetetraacetic 1 ml 0,25% (EDTA) e sospendere la soluzione con l'aiuto di un puntale 1 ml (aka blu punta) 20 volte per 3 minuti. Aggiungere 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 media (Ham) contenente 2% di siero fetale bovino. Raccogliere i tessuti per centrifugazione (600 RCF, 5 min, temperatura ambiente (RT)), e aggiungere 1 ml di tampone di digestione 2 (DMEM F12 () medio di Ham integrato con 7 mg ml -1 dispasi II e 10 mg ml -1 Deoxyribonuclease I ( DNasi I)). Sospendere il tessuto pellet 20 volte con l'aiuto di una pipetta ti 1 mlp. Aggiungere 5 ml di siero terreno di coltura del mouse tube epitelio completo libero (M-TE-GM, tabella 1). Raccogliere le cellule per centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT). Aggiungere 1 ml di M-TE-GM, sospendere e contare le cellule da emocitometro. Seme 1 x 10 5 cellule in 1 ml per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti partire fissaggio e incubare a M-TE-GM a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 4 giorni. Cambiare la media ogni giorno. Preparare sospensioni singola cella di cellule in coltura di sospensione primario TE dai topi beta-actina-EGFP o β-actina-DsRed. Raccogliere TE colture in sospensione da 24 pozzetti bassi di attacco. Centrifuga (600 RCF, 5 min, RT), e sospendere pellet cellulari con 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA. Incubare per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Interrompere l'attività tripsina con l'aggiunta di 5 ml DMEM / F12 media (Ham) contenente il 5% di siero fetale bovino. Raccogliere pellet cellulari mediante centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT). pellet cellulari lavare due volte con 4 ml di PBS freddo (4 ° C), aggiungere 1 ml di PBS per pellet cellulare, e sospendere. Contare le celle da emocitometro e trasferire a 1,7 ml tubi centrifugazione. Lavorando su ghiaccio, aggiungere 1 x 10 5 cellule per 10 microlitri di PBS, quindi aggiungere matrice membrana basale 10 ml. Sospendere e trasportare sul ghiaccio per la stanza degli animali. Nota: Eseguire tutte le dissezione e il tessuto di lavoro la cultura in un armadio biosicurezza in condizioni sterili. Preparazione di Immortalata linea cellulare umana Separatamente crescere lentivirus-EGFP e -mCherry etichettato immortalato lineHIO118 cellule dell'epitelio ovarico umano superficie fino a 80-90% di confluenza su 10 piatti cm a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Lavare i piatti due volte con 10 ml di PBS, aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA per ogni piatto e incubare per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml DMEM / F12 media (Ham) contenente il 5% di siero fetale bovino. Collezionarepellet cellulari mediante centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT). pellet cellulari lavare due volte con 10 ml di PBS freddo (4 ° C), aggiungere 1 ml di PBS per pellet cellulare, e sospendere. Contare le celle da emocitometro e trasferire a 1,7 ml tubi centrifugazione. Lavorando su ghiaccio, aggiungere 1,0 x 10 6 cellule Lenti-mCherry etichettati + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP etichettato cellule per 10 ml di PBS. Aggiungere matrice membrana basale 10 ml. Sospendere e trasportare sul ghiaccio per la stanza degli animali. Preparazione della tuba uterina Sezionare tube uterine individuali da 6- a 8 settimane di età topi vergini β-actina-DsRed in PBS come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.5. Trasferire tubi singoli uterine in una goccia 200 ml di PBS al microscopio di dissezione. srotolare delicatamente salpingi con l'aiuto di pinzette e 28 aghi calibro rimuovendo il mesosalpinge, una porzione del legamento largo che supporta i segmenti del tubo uterino. Posizionare singoli tube uterine srotolò in una goccia di 200 ml ghiacciata PBS fino cuscinetto adiposo ovarico del destinatario è esposto e preparati a ricevere il trapianto. 2. ovarico Fat Pad Trapianti Nota: disinfettare gli strumenti tra ogni intervento chirurgico animale. Preparare e organizzare tutte le attrezzature in anticipo. trapianti dorsali al cuscinetto adiposo ovarico destra sono preferenziale come questo evita la milza. Tuttavia, i destinatari possono avere trapianti in entrambi i cuscinetti di grasso ovariche. Utilizzare topi singenici o grave topi immunodeficienza combinata (SCID / NCR) come destinatari di cellule primarie. Per le cellule umane, come ad esempio le cellule HIO118, / SCID / gamma topi uso Nod (GFN) o topi SCID. Anestetizzare topo ricevente con una singola iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoethanol alla dose di 0,15 ml / 10 g di peso corporeo. Posto l'animale su una piastra elettrica, nella cappa animale e confermare il corretto anestesia da perdita di pedale riflesso (pinch tep). Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza, mentre ilanimale è sotto anestesia. Iniettare il sottocutanea animale con l'analgesico ketoprofene alla dose di 4 mg / g di peso corporeo per trattare per il dolore post-operatorio. Nota: In alternativa, utilizzare isoflurano per l'anestesia. Posto l'animale in camera di induzione e regolare il flussometro di ossigeno a 0,8-1,5 L / min e il vaporizzatore isoflurano al 2-3%. Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera, lasciate respirare isoflurano da una maschera e impostare il flussometro di ossigeno a 0,4-0,8 L / min e il vaporizzatore isoflurano al 1,5%, quindi avviare l'intervento chirurgico. Radere l'area chirurgica con # 40 Clippers; rimuovere i capelli da una zona 2 volte l'area chirurgica, preparare la pelle rasata con tre scrub antisettico di povidone-iodio, seguito da etanolo al 70%, e coprire con un telo sterile. Spostare l'animale sotto un microscopio dissezione situato in un armadio biosicurezza. Esporre il tratto riproduttivo da un'incisione nella posizione dorsomediale direttamente al di sopra del cuscinetto adiposo ovarico. Nota: Critical step: Precise incisione cutanea favorisce la guarigione della ferita, l'uso di un bisturi è raccomandato nel passo 2.4. Utilizzando una pinza sottile smussato tirare il cuscinetto adiposo ovarico con attenzione attraverso l'incisione verso la linea mediana, riducendo al minimo i danni ai nervi e vasi sanguigni principali. Passo fondamentale: se si verifica il sanguinamento, fermare l'intervento chirurgico e prendere in considerazione il trapianto a un altro animale ospite. Sotto il controllo del microscopio dissezione con l'aiuto di un ago calibro 28 smussato fare una incisione profonda 2-4 mm nel cuscinetto adiposo ovarico, 3-4 mm sopra l'ovaio. passaggio fondamentale: Assicurarsi che l'incisione va solo attraverso la metà del cuscinetto adiposo; puntura tutto il percorso attraverso il lato inferiore provoca perdite. Essere rapidi e procedere senza indugio dopo questo passaggio. Per i trapianti di cellule, riempire una siringa (ago da 30 gauge) con 10-20 ml della cellula-membrana basale matrice della miscela e iniettare l'incisione cuscinetto adiposo. Per il trapianto di tuba uterina, prendere l'ingegno tubo uterinoh pinza sottile e posto in 10 – matrice di membrana basale di 20 ml tenuti in ghiaccio. Utilizzando un 0.1-10 / 20 ml XL è laureato punta filtro (accorciata di 3 mm) prendere il tessuto e membrana basale sospensione matrice e rilasciare nell'incisione cuscinetto adiposo. Attendere 5 minuti per la matrice membrana basale a solidificare e posizionare il tratto riproduttivo di nuovo nel peritoneo. Chiudere i muscoli con 2 stiches di sutura chirurgica e la pelle con due clip piccola ferita o sutura chirurgica. Ripetere i passaggi 2,4-2,8 per trapiantare una membrana PBS-interrato matrice miscela nel cuscinetto adiposo contra-laterale dell'animale che servirà come controllo. passaggio fondamentale: Dopo l'intervento chirurgico posto l'animale su una piastra elettrica, perché la perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati. Lasciate animale recuperare su una piastra elettrica nella gabbia nativo e osservare l'animale fino a quando completamente sveglia dall'anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere sternal prona. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Mettere una manciata di pellet cibo pre-umido all'interno della gabbia in aggiunta al cibo secco sulla gabbia dopo l'intervento chirurgico. Applicare analgesici post-chirurgica, se necessario, per i prossimi giorni ed esaminare la ferita quotidiano. Applicare gli antibiotici secondo il protocollo approvato animale in caso di infezione della ferita. Rimuovere clip ferita 10 giorni dopo l'intervento quando la ferita è completamente chiuso. 3. Istologia e Image Acquisition Graft raccolta e conservazione Preparare la soluzione paraformaldeide 4% miscelando 26 ml DDH 2 O con 4 ml 10x PBS e soluzione di paraformaldeide 10 ml 16%. Sezionare in un unico blocco, il pad innestato ovarico grasso, ovaio, tube uterine, 0,5 centimetri utero come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.4. Porre immediatamente in 2 ml di paraformaldeide al 4% e fissare per 2 ore, a temperatura ambiente. Dal stesso animale, sezionare il non-innestatocontrolaterale sistema cuscinetto adiposo ovarico trapiantato con PBS-interrato miscela matrice di membrana come controllo (vedi punto 2.9). Fix e processo nello stesso modo. Dopo lavaggio fissaggio dei tessuti tre volte con PBS per 5 minuti e incubare una notte in PBS a 4 ° C. Per tutto il montaggio di immagini del cuscinetto adiposo ovarico procedere al punto 3.2.1. Nota: Dopo che i tessuti di acquisizione di immagini possono essere congelati (3.3.1) o trattati per paraffina (3.3.2). notte di incubazione in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C migliora la qualità dei tessuti congelati. Acquisizione dell'immagine Posto tutto il montaggio ovariche sistemi cuscinetto adiposo in piatti PBS pieni e immagine utilizzando un microscopio invertito dotato di attaccamento epi-fluorescenza e telecamera a colori ad alta definizione, con 4, 10x obiettivi, e uno stereomicroscopio dotato di un allegato di fluorescenza, telecamera a colori e Piano Apo 1xWD70, obiettivi ED Piano 1.5xWD45. Istologia A seguiretutto il montaggio di acquisizione delle immagini (3.2.1) Mettere una goccia 200-500 ml di mezzo di inclusione per i campioni di tessuto congelato su un 2 x 1 cm pezzo di pellicola di laboratorio e l'utilizzo di pinze, di trasferire il tessuto al calo. Sollevare il film al un bordo e trasferire la caduta dei tessuti-media per un ml Fiala criogenico 1.8. Chiudere la fiala ed immergersi in azoto liquido. Conservare tessuti congelati a -80 ° C. In alternativa, procedere con l'incorporamento di paraffina standard. Utilizzare 20-40 volumi di volume del tessuto per ogni passaggio. Immergere i tessuti una volta nel 65% di etanolo per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente. Immergere i tessuti una volta in etanolo al 70% per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente. In questa fase i campioni possono essere conservati per mesi a temperatura ambiente. Immergere tessuti volta in etanolo al 90% per 30 minuti, agitando delicatamente a RT. Immergere tessuti volta in etanolo al 95% per 30 minuti, agitando delicatamente a RT. Immergere tessuti due volte in etanolo assoluto (200 proof) per 30 minuti, agitando delicatamente a RT. <li> Immergere tessuti due volte in cloroformio per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 30 minuti, agitando delicatamente a 58 ° C. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 12 ore, scuotendo delicatamente a 58 ° C. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 3 ore, a 58 ° C. Mettere i tessuti in stampi di metallo istologia e riempire stampi con 58 ° C di paraffina. Aggiungere una cassetta istologia plastica sulla parte superiore della paraffina e raffreddare paraffina a +4 ° C. Estrarre blocco di paraffina-tessuto e conservare a temperatura ambiente. Nota: Temperatura di paraffina non deve superare i 58 ° C per la conservazione ottimale del tessuto adatto per la colorazione immunoistochimica. In alternativa, Preparati per la paraffina con il campione di elaborazione del gel. Aspirare il PBS e il trasferimento dei tessuti tutto il montaggio al 70% di etanolo. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore. In un bagno d'acqua, campione preriscaldamento elaborazione gel a 60 ° C. Pipette 200 ml di gel di elaborazione campione sul una capsula di Petri laboratorio di cinema-allineati. Uso di pinze dissezione multa trasferire l'intero sistema di montaggio dei tessuti per la caduta di gel di trattamento dei campioni. Lasciare la spina gel trattamento dei campioni solidificare a temperatura ambiente, o solidificare la spina per 10 min a 4 ° C. Posizionare il tessuto incorporato gel di trattamento dei campioni in cassette di tessuto istologia inserita tra imbottiture biopsia. Incorpora in paraffina come nei passaggi 3.3.2-3.3.2.10. Nota: Procedura sul campione gel incorporamento previene la perdita e permette la conservazione di piccoli campioni di tessuto fragile. Nota: I tessuti conservati per congelamento o paraffina sono adatti per la colorazione immunoistochimica 14,15.