Kwantitatieve meting van relatieve retinoïnezuur Levels in E8.5 embryo's en neurosfeerculturen Met behulp van de F9 RARE-lacZ-Cell gebaseerde Reporter Assay

Alle dierlijke werk werd gedaan op basis van goedgekeurde Rutgers-RWJMS IACUC methoden. 1. Solution en Media Voorbereiding Bereid voorraad en buffer oplossingen als per tabel 1. Bereid werkende oplossingen als per tabel 2. 2. Cultuur en onderhoud van F9 RARE-LacZ cellen Ontdooien bevroren cellen Bereid F9 RARE-LacZ celcultuurmedium als omschreven in tabel 2. Coat 10 cm kweekschalen (celcultuur behandeld) met 10 ml 0,2% gelatine (zie Tabel 2) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Afwassen overtollige gelatine met twee spoelingen van 10 ml gedestilleerd water. Onmiddellijk voeg 9 ml F9 RARE-LacZ celcultuurmedium in de kolf om de gelatine van uitdroging te voorkomen. Dooi een flacon van F9 RARE-LacZ cellen 14 in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 min. Plaat cellen (ongeveer 1 x 10 6 cellen / ml) in de gecoate schaal containing 9 ml kweekmedium. Kweken bij 37 ° C, 5% CO2. Verander het medium de volgende dag. Onderhoud van F9 RARE-LacZ cellen Bent regelmatig passage elke 2-3 dagen in een verhouding van 01:10. Opmerking: Laat de cellen groeien tot confluentie, omdat dit zal resulteren in hun differentiatie. Splits het kweken bij een confluentie van 80-90%. Verwijder het medium en was de cellen met 10 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine, incubeer gedurende 5 min. Voeg 9 ml kweekmedium, pipet op en neer en split cellen 1:10 voor de passage. Invriezen F9 RARE-LacZ cellen Trypsinize een 10 cm schotel met F9 RARE-LacZ cellen bij 80-90% samenvloeiing zoals beschreven in stap 2.2.2. Breng de gedissocieerde cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeren bij 200 g gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 10 ml F9 RARE-LacZ freezing medium (zie tabel 2). Aliquot 1 ml in gelabelde cryovials en overdracht flacons in het vriespunt containers. Plaats bevriezing container in -80 ° C vriezer O / N en overdracht flesjes tanks vloeibare stikstof de volgende dag. 3. Dissectie van E8.5 embryo's Paring Cage Set-up en Plug Controle Set-up van een paring kooi met één koppelen paar. De ochtend van de volgende dag, controleren op de aanwezigheid van een vaginale plug en wijzen de dag een stekker wordt gevonden als de dag 0,5 23. Op dag E8.5, oogst embryo's. Dissectie van embryo's Offer de dam door middel van cervicale dislocatie en spuit de buikstreek met 70% ethanol (zie tabel 2). Voeg een dwarse snede op de huid boven de buik behulp chirurgische schaar en trek de twee flappen uit elkaar (voorste en achterste) tegen het buikgebied bloot. Maak een soortgelijke cuthet peritoneum aan de buik bloot. Zoek de baarmoeders en laat baarmoeders van de eileiders en mesometrium met behulp van een schaar 23. Plaats de baarmoeders in een 6 cm schotel (non-celcultuur behandeld) met 10 ml 1x PBS om overtollig vet en bloed af te wassen. Transfer naar een andere 6 cm schaal met vers 10 ml 1x PBS. Aparte een baarmoeder met één embryo door te snijden uit met chirurgische schaar. Verwijder de baarmoeder en decidua en de dooierzak die de embryo u twee paar niet los. 5 pincet 23. Scheid de dooierzak van het embryo en de dooierzak overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis voor genomisch DNA extractie wordt gebruikt voor genotypering. Gebruik een P20 pipet met brede boring tip, breng het hele embryo in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 10 ul trypsine. Plaats de buis op ijs. Herhaal stap 3.2.3 – 3.2.4 tot alle embryo's werden ontleed. embryo Dissociatie Incubeer de 1,5 ml buisjes met embryo trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min enzymatische dissociatie vergemakkelijken. Fijnstampen zachtjes met een P20 pipet voor mechanische dissociatie van het embryo en plaat het gehele 10 pl volume met een gedissocieerde embryo over één putje van F9 RARE-LacZ cellen in een 96-putjesplaat (zie stap 5.1 voor plateren F9 RARE-LacZ cellen in een 96-well plaat). Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2. 4. Laminectomie, Dissectie van volwassen lumbale ruggenmerg en neurosfeercultuur laminectomie Offer een volwassene (P60) muis door cervicale dislocatie. Spuit de dorsale kant met 70% ethanol en een dwarse snede behulp chirurgische schaar. Trek beide kleppen (voorste en achterste) uit elkaar om de rug en wervelkolom bloot te leggen. Met behulp van chirurgische schaar, trimmen van de spieren die de wervelkolom.Zoek de lumbale regio van het ruggenmerg, onder de ribben. Met de schaar, maken een diepe snede op de rug verbreken op die plaats en het ruggenmerg bloot. Trek de lumbale regio van de wervelkolom zonder. 5 forceps zodat de belichte dwarsdoorsnede van het ruggenmerg wordt geconfronteerd met de experimentator. Met de tips van fijne schaar, knip de wervel en spier op de 3 uur en 9 uur posities van het blootgestelde uiteinde. Pak de dorsale flap van de snede wervel met een tang. Blijven deze verlagingen caudaal tot de lengte van het lumbale ruggenmerg wordt blootgesteld. Laat het ruggenmerg van de wervels met behulp van niet. 5 en stompe uiteinden tang. Transfer het ruggenmerg naar een 15 ml buis met 3 ml DMEM / F12 kweekmedium. Blijf op ijs totdat alle lumbale ruggenmerg zijn geïsoleerd. Spinal Cord Dissection Giet het kweekmedium met het ruggenmerg in een 6 cm schotel (non-celcultuur behandeld). Onder een stereomicroscoop, verwijder de dorsale wortel ganglia en bloedvaten rond het koord segment spinale door grijpen de ganglia en bloedvaten met behulp van twee paren van niet. 5 pincet en voorzichtig los te trekken van het ruggenmerg. Breng de kabel segment spinale naar een 6 cm schotel zonder medium en gehakt het weefsel fijn met behulp van een scalpel. Overdracht gehakt weefsel 15 ml buisje met 1 ml neurosphere dissociatie media (zie tabel 2). Zet buis op ijs en herhaal de stappen 4.2.1 – 4.2.2 tot alle ruggenmerg zijn verwerkt. Incubeer buisjes met gehakt weefsel dissociatie medium bij 37 ° C gedurende 10 min, flick de buis aan de kant te mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende nog 10 min. Na enzymatische afbraak, fijnstampen met vuur gepolijst pipetten van afnemende diameters voor de mechanische dissociatie. Let op: Bereid brand-gepolijst pipetten van afnemende diameters voor het uitvoeren van experimenten. Neem een ​​glas Pasteurpipet en sluit het brede uiteinde met schone katoen. Met een alcohol lamp, vuur polijsten de uiteinden van de pipetten in de vlam verschillende diameters maken: "normale", "fijne" en "extra fine". Voor "normale" gepolijst pipetten, draai het uiteinde van de pipet in de vlam ronde van de randen zonder het verminderen van de diameter (~ 1 mm). Draai het uiteinde van de pipet in de vlam van een iets langere perioden "fine" (~> 1 mm en> 5 mm diameter) en "extra fijn" (~ 0,5 mm) gepolijst pipetten maken. Niet pipetten gebruiken met een diameter kleiner dan 0,5 mm. neurosfeercultuur Spin down buizen die los ruggenmerg weefsel bij 200 g gedurende 10 min. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml neurosphere kweekmedium (zie tabel 2). Vermaal met een P1,000 pipet gevolgd door een P200 pipet dissociatie vergemakkelijken. Opmerking: Vermijd het introduceren van bellen,die cellevensvatbaarheid zou verminderen. Breng 10 pl van gedissocieerde cellen in een hemocytometer en het verkrijgen van een celgetal. Plaat cellen bij een dichtheid van 1×10 5/10 ml in een T25 kolf met 10 ml neurosphere kweekmedium. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 7 dagen tot 24 neurosferen weergegeven. neurosphere Dissociatie Neurosfeercultuur verzamelen en overbrengen naar 15 ml buizen. Spin bij 200 xg gedurende 10 min. Verwijder het grootste deel van de bovenstaande vloeistof zodat er nog 1 ml achter. Vermaal met een P1,000 pipet naar de cel pellet opnieuw in suspensie en distantiëren neurospheres in enkele cellen. Overdracht 10 ul van gescheiden cellen in een hemocytometer en krijgen een celgetal. Plaat 1 x 10 5 gescheiden neurosphere cellen over een put van F9 RARE-LacZ in een 96-well plaat (zie paragraaf 5.1 voor plating F9 RARE-LacZ in 96-well plaat). Plate 3 putten als herhalingen. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2. 5. RA Assay van E8.5 embryo's en Spinal Cord Neurosferen Plating F9 RARE-LacZ in 96-well plaat Eén dag vóór de oogst E8.5 embryo of dissociatie van neurosferen, laag een 96-wells plaat met 100 pl 0,2% gelatine per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren de gelatine en spoel tweemaal met 200 gl gedestilleerd water. Trypsinize F9 RARE-LacZ cellen aangehouden in 10 cm schalen zoals beschreven in stap 2.2.2. Plaat 1 x 10 5 cellen / putje van F9-RARE LacZ cellen, maar dit keer met behulp van cultuur medium zonder G418. Bereid genoeg putjes co-kweek van embryo's (~ 12-20, afhankelijk van de worpgrootte), neurosferen (3 putjes / genotype) en een standaardcurve in drievoud (27 putjes). Co-cultuur van F9 RARE-LacZ en E8.5 embryo's of Spinal Cord Neurosferen Harvest embryo's zoals beschreven in paragraaf 3.2 en plaat op de top van F9RARE-LacZ in de 96-well plaat uit paragraaf 5.1. Op soortgelijke wijze dissociëren neurosferen en plaat bovenop F9 RARE-LacZ in de 96-well plaat zoals beschreven in stap 4.4. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2. Het genereren van een Standard Curve Een standaardcurve bereiden all-trans RA (om-RA) oplossingen met de volgende concentraties: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM door seriële verdunning van de grens RA voorraad (zie tabel 1) met F9 RARE-LacZ kweekmedium. Voeg 100 ul van deze verschillende bij RA-concentraties F9 RARE-LacZ cellen uit paragraaf 5.1. Wijs putjes die onbehandeld F9 RARE-LacZ cellen als negatieve controle. Bereid drievoud van elke RA concentratie en negatieve controleputjes. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: F9 RARE-LacZ cellen reageren op een dosis-afhankelijke lineair variërende concentraties van all-trans RA. RA Assay Na O / N kweek van de 96-well plaat met de standaard curves en co-culturen, verwijder de media en de kweken te lossen door het toevoegen van 100 pi 2,5% glutaraldehyde (zie Tabel 2) gedurende 15 min, RT. Verwijder de fixerende en tweemaal wassen met 200 ul 1x PBS, 10 min per wasbeurt. Verwijder PBS en was driemaal met 200 ul van de LacZ wasoplossing (zie tabel 2), 10 min per wasbeurt. Tijdens de derde maal, bereidt de X-gal kleuroplossing in een 15 ml buis omwikkeld met folie (zie tabel 2). Berekenen hoeveel kleuroplossing nodig is en de voorbereiding van de juiste hoeveelheid (200 ul / putje). Let op: X-gal kleuring oplossing is lichtgevoelig. Gebruik de kleuroplossing binnen 15 minuten na bereiding. Bereid een bevochtigde kamer door een papieren doek bevochtigd met gedestilleerd water in een plastic container groot genoeg om een ​​96-wells plaat houden. Voeg 200 ul van de XGal kleuroplossing per putje van de 96-well plaat en plaats de plaat in een bevochtigde kamer. Incubeer vochtige kamer met de 96-puts plaat bij 37 ° C om voor de ontwikkeling van blauw gekleurde neerslag. Voor E8.5 embryo's, broeden de plaat O / N (12-16 uur). Voor neurosphere culturen, incubeer de plaat gedurende 4-8 uur. Het lezen van absorptie bij OD 610 en Imaging Na kleur reactie, verwijder de LacZ kleuroplossing en te vervangen door 200 ul 1x PBS. Meet de absorptie bij 610 nm onder toepassing van een standaard ELISA-plaatlezer om de reporter respons op RA kwantificeren. Afbeelding afzonderlijke putjes met een standaard stereomicroscoop uitgerust met een camera. 6. Subklonering van F9 RARE-LacZ cellen Controle F9 RARE-LacZ rResponse RA Voor het begin van experimenten, testen van de reactie van F9 RARE-LacZ cellen RA. Plaat F9 RARE-LacZ cells in 96-well plaat (zie paragraaf 5.1), en voeg 1 nM all-trans retinoïnezuur (zie stap 5.3). Incuberen in een bevochtigde kamer bij 37 ° CO / N. Visualiseer ontwikkeling van blauw gekleurde neerslag met behulp van een microscoop. Als kleurontwikkeling is niet gelijkmatig over de cellen in het putje (zie figuur 1B, links), voert subkloneren hieronder. Subklonering van F9 RARE-LacZ cellen Splits de F9 RARE-LacZ cellen gekweekt in 10 cm schalen zoals beschreven in stap 2.2.2. In plaats van een 01:10 verhouding, een plaat lage zaaidichtheid van 1 x 10 5 cellen / 10 ml in een 10 cm schaal om groei van geïsoleerde kolonies zodat elke kolonie voortvloeit uit een F9 RARE-LacZ cellen. Na twee dagen, laag een 24-putjes plaat met 500 pl 0,2% gelatine per putje gedurende 30 minuten. Verwijder gelatine-oplossing en tweemaal spoelen putten met 500 pi gedestilleerd water. Vervang water met 500 ul van F9 RARE-LacZ celkweekmedium. Kies een kolonie met een steriele P10 pipet en overdracht in een put; doen 24 keer tot 24 afzonderlijke kolonies te verkrijgen. Kweken bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 3-4 dagen. Verdeel de individuele kolonies in twee 24-well platen. Na 2 dagen in kweek, voeg 1 nM RA aan elk putje van een 24-wells plaat en cultuur O / N. Voer LacZ kleuring zoals beschreven in paragraaf 5.4 om te testen op hoge responders. Visualiseer kleur reactie van elk putje onder een microscoop om sterke en uniforme responders te bepalen. Zodra een sterke subkloon responder wordt bepaald, breiden de overeenkomstige cultuur van de andere 24-wells plaat. Verder uit te breiden dat de kolonie in een 10 cm schotel, bevriezen neer meerdere flacons zoals beschreven in paragraaf 2.3, en gooi alle andere koloniën. Opmerking: slechts ongeveer een kwart van het oorspronkelijke kolonies leiden tot hoge responders. Meestal raakt de eerste ronde van subklonering niet tot uniform LacZ kleuring en een volgende ronde van subklonering moet worden gedaanbereiken uniform sterke responders.