Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com métodos Rutgers-RWJMS IACUC aprovados. 1. Solução e Mídia Preparação Prepare ações e tampão soluções conforme a Tabela 1. Preparar as soluções de trabalho de acordo com a Tabela 2. 2. Cultura e Manutenção de células RARE-LacZ F9 As células congeladas descongelamento Preparar o meio de cultura de células F9 RARO-LacZ como detalhado na Tabela 2. O revestimento 10 cm placas de cultura (cultura de células tratadas) com 10 ml de 0,2% de gelatina (consulte a Tabela 2) durante 30 min à TA. Lavar o excesso de gelatina com duas lavagens de 10 ml de água destilada. Imediatamente adicionar 9 ml de meio de cultura de células raras-LacZ F9 para o balão para evitar que a gelatina seque. Descongelar uma ampola de células F9 RARO-LacZ 14 num banho de água a 37 ° C durante 2-3 min. Células da placa (cerca de 1 x 10 6 culas / ml) para a placa revestida containing 9 ml de meio de cultura. Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Mudar o meio do dia seguinte. Manutenção da F9 raras células-LacZ Manter uma passagem regular, a cada 2 – 3 dias a uma razão de 1:10. Nota: Não deixe que as células crescem em confluência, pois isso irá resultar em sua diferenciação. Dividir as culturas a uma confluência de 80-90%. Remover os meios e lava-se as células com 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS). Remover o PBS e adicionar 1 ml de tripsina, incubar por 5 min. Adicionar 9 ml de meio de cultura, pipeta cima e para baixo e dividir células 01:10 para a passagem. Congelamento F9 raras células-LacZ Tripsinizar um prato de 10 centímetros contendo raras células F9-lacZ a 80 – 90% de confluência como detalhado no passo 2.2.2. Transferir as células dissociadas num tubo de centrifugação de 15 mL e centrifugação a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular em 10 ml de F9 RARE-LacZ freezing médio (ver Tabela 2). Aliquota de 1 ml em criotubos e frascos rotulados transferir para recipientes de congelamento. Coloque recipiente de congelamento em O N e transferência de frascos de -80 ° C congelador / para tanques de nitrogênio líquido no dia seguinte. 3. Dissecção da E8.5 embriões Acasalamento gaiola Set-up e bujão de verificação Set-up uma gaiola de acasalamento contendo um par de acasalamento. Na manhã do dia seguinte, para verificar a presença de um plug vaginal e designar o dia um plug é encontrado como o dia 0,5 23. No dia E8.5, embriões colheita. Dissecação de embriões Sacrificar a barragem por deslocamento cervical e pulverizar a área abdominal com etanol 70% (ver Tabela 2). Adicione um corte transversal sobre a pele acima do abdómen usando tesouras cirúrgicas e puxar as duas abas à parte (anterior e posterior) para expor a região abdominal. Faça um corte semelhanteno peritoneu para expor o abdómen. Localize os úteros e solte úteros das tubas uterinas e mesométrio usando um par de tesouras 23. Colocar os úteros em um (cultura de células não-tratadas) disco de 6 cm com 10 ml de PBS 1x para lavar o excesso de gordura e o sangue. Transferir para um outro prato de 6 centímetros contendo frescos 10 ml de 1x PBS. Separe um útero que contém um embrião, cortando-a com uma tesoura cirúrgica. Remover o útero e decídua e libertar o saco vitelino, contendo o embrião usando dois pares de NO. 5 fórceps 23. Separa-se o saco vitelino a partir do embrião, e transferir o saco vitelino para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, durante a extracção do ADN genómico para ser usado para determinação do genótipo. Usar uma pipeta P20 com uma ponta grande calibre, transferir todo o embrião para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 10 ul de tripsina. Colocar o tubo em gelo. Repita os passos 3.2.3 – 3.2.4 até que todos os embriões foram dissecados. A dissociação embrião Incubar os tubos de 1,5 ml contendo embriões em tripsina a 37 ° C durante 5 min para facilitar a dissociação enzimática. Tritura-se suavemente com uma pipeta de P20 para a dissociação mecânica do embrião, e a placa do volume de 10 ul total contendo um embrião dissociado sobre um poço de células RARO-LacZ F9 em uma placa de 96 poços (ver passo 5.1 para o plaqueamento de células F9 RARO-LacZ numa placa de 96 poços). Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. 4. Laminectomy, Dissecção do Adulto lombar Spinal Cord e Cultura Neurosphere laminectomia Sacrificar um rato (P60) adulto por deslocamento cervical. Spray de lado dorsal com 70% de etanol e fazer um corte transversal usando uma tesoura cirúrgica. Puxar ambas as abas (anterior e posterior) afastados para expor a parte de trás e da coluna vertebral. Usando uma tesoura cirúrgica, aparar os músculos que cobrem a espinha.Localizar a região lombar da medula espinal, abaixo das costelas. Usando a tesoura, fazer um corte profundo para cortar a coluna vertebral nesse ponto para expor a medula espinhal. Puxar para cima a região lombar da coluna vertebral sem. 5 fórceps de modo a que a secção transversal exposta da medula espinal está de frente para o experimentador. Usando as pontas de uma tesoura fina, cortar a vértebra e músculo nas posições 3 e 9 horas da extremidade exposta. Segure a retalho dorsal da vértebra corte com uma pinça. Continuar estas cortes caudalmente até que o comprimento da medula espinal lombar está exposta. Libertar a medula espinal a partir das vértebras usando nenhuma. 5, bem como uma pinça de extremidades rombas. Transferir a medula espinal para um tubo de 15 ml contendo 3 ml de meio / cultura de DMEM F12. Manter em gelo até que todas as medulas espinhais lombares foram isolados. Dissecção da medula espinhal Verter o meio de cultura com a medula espinal em um disco de 6 cm (não-tratado de cultura de células). Sob um microscópio estereoscópico, remover os gânglios da raiz dorsal e dos vasos sanguíneos em torno do segmento da espinal medula, agarrando os vasos sanguíneos e dos gânglios utilizando dois pares de NO. 5 pinças e puxando-os para longe da medula espinhal. Transferir o segmento da medula espinhal para um disco de 6 cm com nenhum meio e pique finamente o tecido usando uma lâmina de bisturi. Transferência tecido moído para tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio de dissociação neuroesfera (ver Tabela 2). Colocar o tubo em gelo e repita os passos 4.2.1 – 4.2.2 até que todas as medulas espinhais foram processadas. Incubar os tubos contendo tecido picada em meio de dissociação a 37 ° C durante 10 min, passe rapidamente o tubo no lado de misturar e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante mais 10 min. Após a digestão enzimática, triturar com pipetas polido-fogo de diminuir diâmetros para a dissociação mecânica. Nota: Preparar pipetas fogo-polido de diminuir diâmetros antes de realizar experimentos. Tome um copo Pasteurpipeta e ligue a grande final com algodão limpo. Usando uma lâmpada de álcool, fogo polonês as pontas das pipetas na chama para criar diferentes diâmetros: "regular", "fino" e "extra fino". Para pipetas polidas "regulares", girar a extremidade da pipeta na chama de volta das bordas sem diminuir o diâmetro (~ 1 mm). Gire a extremidade da pipeta na chama por períodos um pouco mais para criar "fino" (~> 1 mm e> 5 mm de diâmetro) e "extra fino" (~ 0,5 mm) pipetas polidas. Não utilizar pipetas com diâmetros inferiores a 0,5 mm. Cultura neurosphere Spin down tubos contendo dissociada tecido da medula espinhal a 200 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura neuroesfera (ver Tabela 2). Tritura-se com uma pipeta P1,000 seguido por uma pipeta P200 para facilitar a dissociação. Nota: Evite bolhas de introdução,que iria diminuir a viabilidade celular. Transferir 10 uL de células dissociadas num hemocitómetro e obter uma contagem de células. As células em placas a uma densidade de 1×10 5/10 ml num frasco T25 com 10 ml de meio de cultura neuroesfera. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 7 dias, até aparecer 24 neuroesferas. neurosphere dissociação Recolha cultura neurosphere e transferir para tubos de 15 ml. Girar a 200 xg durante 10 min. Remover a maior parte do sobrenadante deixando atrás de 1 ml. Tritura-se com uma pipeta P1,000 para ressuspender o sedimento celular e dissociar neuroesferas em células individuais. Transferir 10 uL de células dissociadas num hemocitómetro e obter uma contagem de células. Placa 1 x 10 5 células dissociadas neuroesferas sobre um poço de F9 RARO-LacZ em uma placa de 96 poços (ver secção 5.1 para plaqueamento F9 RARO-LacZ na placa de 96 poços). Placa 3 poços como repetições. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. 5. RA Ensaio de E8.5 embriões e Medula Espinhal neuroesferas Chapeamento F9 RARE-LacZ na placa de 96 poços Um dia antes da colheita de embriões E8.5 ou dissociação de neuroesferas, revestimento de uma placa de 96 poços com 100 ul de 0,2% de gelatina por poço, durante 30 min à temperatura ambiente. Aspirar a gelatina e lavar duas vezes com 200 ul de água destilada. Trypsinize F9 raras células-LacZ mantidas em placas de 10 cm, conforme detalhado na etapa 2.2.2. Placa 1 x 10 5 células / poço de células LacZ F9-raras, mas desta vez usando meio de cultura sem G418. Prepare o suficiente para poços de co-cultura de embriões (~ 12-20, dependendo do tamanho da ninhada), neuroesferas (3 poços / genótipo), bem como para uma curva padrão em triplicado (27 poços). Co-cultura de F9 RARE-LacZ e E8.5 embriões ou da medula espinhal neuroesferas embriões de colheita, conforme detalhado na seção 3.2 e placa em cima da F9Rare-LacZ na placa de 96 poços de secção 5.1. De um modo semelhante, se dissociam neuroesferas e placa no topo de F9 RARO-LacZ na placa de 96 poços como detalhado no passo 4.4. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. Gerando uma curva padrão Para gerar uma curva padrão, preparar todo-trans retinóico (AR-em) soluções com as seguintes concentrações: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, por diluição em série da em- estoque RA (ver Tabela 1) com meio de cultura RARE-LacZ F9. Adicione 100 ml de estes diferentes at-RA concentrações de raras células-LacZ F9 da secção 5.1. Atribuir poços contendo F9 não tratada células RARE-LacZ como controle negativo. Prepare triplicados de cada concentração de AR e poços de controlo negativo. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: raras células F9-LacZ responder de uma forma linear dependente da dose, a concentrações variáveis ​​de RA todo-trans. Ensaio RA Após a cultura D / N da placa de 96 cavidades contendo a curva padrão e co-culturas, remova o material e corrigir as culturas por adição de 100 ul de glutaraldeído a 2,5% (ver Tabela 2) durante 15 min, TA. Remover o fixador e lava-se duas vezes com 200 ul de 1x PBS, 10 min por lavagem. Remover PBS e lavar três vezes com 200 ul da solução de lavagem de LacZ (ver Tabela 2), 10 min por lavagem. Durante a terceira lavagem, preparar a solução de coloração com X-gal em um tubo de 15 ml envolvido em folha (ver Tabela 2). Calcular a quantidade de solução de coloração é necessário preparar e a quantidade apropriada (200 ul / poço). Nota: solução de coloração X-gal é sensível à luz. Use a solução de coloração dentro de 15 minutos após a preparação. Prepara-se uma câmara humidificada, colocando uma toalha de papel humedecido com água destilada para um recipiente de plástico grande o suficiente para segurar uma placa de 96 poços. Adicionar 200 uL de Xsolução de coloração -gal por poço da placa de 96 poços e colocar a placa numa câmara humidificada. Incubar câmara humidificada contendo a placa de 96 poços a 37 ° C para permitir o desenvolvimento de um precipitado de cor azul. Para os embriões E8.5, incubar a placa de O / N (12 – 16 horas). Para culturas de neuroesferas, incubar a placa durante 4-8 horas. Leitura da absorvância a 610 OD e imagem Após a reação de cor, remova a solução de coloração LacZ e substituir com 200 ul 1x PBS. Medir a absorvância a 610 nm utilizando um leitor de placas ELISA padrão para quantificar a resposta repórter para RA. Imagem poços individuais usando um microscópio estereoscópico padrão equipado com uma câmera. 6. Subclonagem de F9 raras células-LacZ Verificando F9 RARE-LacZ rResponse à AR Antes de iniciar quaisquer experiências, testar a resposta das células RARE-LacZ F9 para RA. Placa F9 RARE-LacZ cells em placas de 96 poços (ver secção 5.1), e adicione 1 nM all-trans ácido retinóico (veja o passo 5.3). Incubar numa câmara humidificada a 37 ° CO / N. Visualize desenvolvimento de precipitado de cor azul usando um microscópio. Se o desenvolvimento de cor não é uniforme por todas as células no poço (ver Figura 1B, à esquerda), efectuar a subclonagem detalhado abaixo. Subclonagem de F9 raras células-LacZ Dividir as células RARE-LacZ F9 cultivadas em placas de 10 cm, conforme detalhado na etapa 2.2.2. Em vez de uma razão de 1:10, chapear uma baixa densidade de semeadura de 1 x 10 5 células / 10 ml numa placa de 10 cm para permitir o crescimento de colónias isoladas de tal modo que cada colónia surge a partir de uma célula RARO-LacZ único F9. Após dois dias, revestimento de uma placa de 24 poços com 500 ul de 0,2% de gelatina por poço, durante 30 min. Remoção da solução de gelatina e lavar os poços duas vezes com 500 mL de água destilada. Substituir a água com 500 mL de meio de cultura celular RARE-LacZ F9. Escolha uma colónia utilizando uma ponta de pipeta estéril P10 ea transferência para um poço; fazer isso 24 vezes para obter 24 colónias individuais. Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 – 4 dias. Dividir as colónias individuais em duas placas de 24 poços. Após 2 dias em cultura, adicionar 1 nM de RA para cada poço de uma placa de 24 poços e cultura D / N. Execute coloração LacZ, conforme detalhado na seção 5.4 para testar altos respondedores. Visualizar reacção de cor de cada poço sob um microscópio para determinar respondedores fortes e uniformes. Uma vez que uma resposta forte do subclone é determinada, expandir a cultura correspondente de outra placa de 24 poços. Expandir ainda mais que a colônia em uma placa de 10 cm, congelar-se vários frascos conforme detalhado na seção 2.3, e descartar todas as outras colônias. Nota: Apenas cerca de um quarto das colônias originais resultar em altos respondedores. Normalmente, a primeira rodada de subclonagem não resulta em coloração LacZ uniforme e uma rodada subseqüente de subclonagem precisa ser feito paraalcançar respondedores fortes uniformes.