F9 RARE-lacZをセルベースレポーターアッセイを使用したE8.5胚および神経球培養における相対的なレチノイン酸レベルの定量的測定

全ての動物作業は承認ラトガース-RWJMS IACUCの方法に従って行いました。 1.ソリューションとメディアの準備 。 表1のとおり株式及び緩衝液を調製表2の通り作業ソリューションを準備します。 2.文化とF9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス 凍結細胞を解凍 表2に詳述されるようにF9 RARE-LacZの細胞培養培地を準備します。 室温で30分間0.2％ゼラチン10mLでコート10cmの培養皿（細胞培養処理された）（ 表2参照）。 10ミリリットルの蒸留水の2回のすすぎで過剰ゼラチンを洗い流します。すぐに乾燥からゼラチンを防止するために、フラスコにF9 RARE-LacZの細胞培養培地の9ミリリットルを追加します。 3分- 2 37℃の水浴中でF9 RARE-LacZ細胞14のバイアルを解凍します。 （1×10 6細胞/ ml程度）プレートセルコートディッシュCに培地の9ミリリットルをontaining。 37℃、5％CO 2で培養。翌日、培地を変更します。 F9 RARE-LacZ細胞のメンテナンス 1：10の割合で3日間 – すべての2定期的な経過を維持します。 注：これは、それらの分化になりますように、細胞がコンフルエントに成長させてはいけません。 80から90パーセントの密集度で培養物を分割します。メディアを取り出して、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の10mlで細胞を洗浄。 PBSを削除し、トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間インキュベートします。培地、上下にピペットおよび分割細胞通過のための午前1時10分の9ミリリットルを追加します。 F9 RARE-LacZ細胞を凍結 ステップ2.2.2で詳述するように、90％コンフルエンス – 80でF9 RARE-LacZ細胞を含む10cmの皿をトリプシン処理。 5分間、200×gで15ミリリットルの遠心分離管とスピンに解離細胞を転送します。 F9 RARE-LacZのFの10ミリリットルで上清と再懸濁細胞ペレットを削除します培地をreezing（ 表2参照）。小分けし、冷凍容器にラベルされたクライオバイアルおよび転送バイアルに1ミリリットル。翌日、液体窒素タンクに-80℃の冷凍庫O / Nと転送バイアルで容器を凍結置きます。 E8.5胚の3解剖 交尾ケージセットアップおよびプラグチェック セットアップ1交配対を含む交尾ケージを。次の日の朝は、膣のプラグインが存在するかを確認し、プラグが1日0.5 23として発見された日を指定します。日E8.5、収穫の胚で。 胚の解剖 （ 表 2を参照）頚椎脱臼を通してダムを生け贄に捧げる、70％エタノールで腹部をスプレー。手術用はさみを使用して腹部の上に皮膚の上にカット横断を作成し、腹部を露出するように離れて2つのフラップ（前方および後方）を引き出します。同じようなカットを作ります腹膜上腹部を露出させます。 子宮を見つけ、はさみ23のペアを使用して卵管と子宮間膜から子宮をリリース。余分な脂肪と血を洗い流し、PBS 1×10ミリリットルとを6cmディッシュ（非細胞培養処理）で子宮を置きます。新鮮な10ミリリットル1×PBSを含む別に6cm皿に移します。 手術用はさみを使用してそれを切断して1胚を含む1子宮セパレート。子宮と脱落膜を取り外し、無の2ペアを使用して胚を含む卵黄嚢をリリース。 5鉗子23。 胚から卵黄嚢を分離し、遺伝子型決定のために使用されるゲノムDNA抽出のために1.5ミリリットルのマイクロチューブに卵黄嚢を転送します。トリプシンの10μLを含む1.5 mlのマイクロチューブに全胚を転送し、広口径の先端でP20ピペットを使用してください。チューブを氷上に置きます。 すべての胚が解剖されるまで3.2.4 – を繰り返して3.2.3を繰り返します。 胚解離酵素的解離を促進するために、37℃で5分間トリプシンで胚を含む1.5 mlチューブをインキュベートします。 粉薬が優しく胚の機械的解離のためのP20ピペッターを使用して、96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZ細胞の1つのウェルの上に1解離した胚を含む全10μlの容量をめっき（F9 RARE-LacZ細胞をプレーティングするためのステップ5.1を参照してください。 96ウェルプレート中）。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 4.椎弓切除、大人腰椎脊髄の解剖と神経球文化 椎弓切除術 頸椎脱臼を通して大人（P60）マウスを生け贄に捧げます。 70％エタノールで背側をスプレーし、手術用はさみを使用して、横方向のカットを行います。背中や脊柱を露出するために離れて、両方のフラップ（前方および後方）を引き出します。 手術用はさみを使用して、背骨を覆う筋肉を切り落とします。肋骨の下、脊髄の腰部の位置を確認します。はさみを使用して、脊髄を露出させるために、この時点で背骨を切断するために、深いカットをします。 なしで脊椎の腰部を引き上げます。 5鉗子は、脊髄の露出横断面は、実験者に向くように。細かいハサミの先端を使用して、露出端の3時と9時の位置で脊椎や筋肉を切り取ります。鉗子で切断された椎骨の背側フラップをつかみます。腰部脊髄の長さが露出するまで尾側にこれらのカットを続けます。 無使用して椎骨から脊髄をリリース。 5と同様に、平滑末端鉗子。 DMEM / F12培地3 mlを含む15mlチューブに脊髄を転送します。すべての腰椎脊髄が単離されているまで氷上で保管してください。 脊髄の解剖 6cmディッシュに脊髄と培地を注ぎ（非細胞培養処理します）。 実体顕微鏡下では、無の2対を用いて神経節や血管を把持することにより、脊髄セグメントの周りに後根神経節と血管を削除します。 5鉗子、ゆっくりと脊髄からそれらを引き離します。無媒体とを6cmディッシュに脊髄セグメントを移し、細かく手術用メスの刃を用いて組織をミンチ。 ニューロスフェアの解離培地1mlを含有する15mlチューブに移し刻んだ組織（ 表2参照）。氷の上にチューブを入れて、手順4.2.1繰り返す – すべての脊髄が処理されるまで4.2.2を。 10分間37℃で解離培地中で細分化した組織を含むチューブをインキュベートし、混合した後、さらに10分間37℃でインキュベートする側のチューブをフリック。酵素消化した後、機械的解離のための直径を減少させるファイアーポリッシュピペットで粉砕します。 注意：実験を実行する前に直径を減少させるファイアーポリッシュピペットを準備します。ガラスパスツールを取りますピペットとは、きれいな綿との広い方の端を差し込みます。 、「レギュラー」「ファイン」、および「極細」：異なる直径を作成するために、アルコールランプ、火ポリッシュ炎でピペットの先端を使用。 "通常の"洗練されたピペットは、直径（〜1ミリメートル）を低下させることなく、エッジのラウンドに難ピペットの終わりを振り回します。 「細かい」（〜> 1ミリメートルと>直径5mm）と「極細」（〜0.5ミリメートル）洗練されたピペットを作成するために、わずかに長い期間のための火炎中でピペットの端を回転させます。 0.5ミリメートル未満の直径を持つピペットを使用しないでください。 ニューロスフェアの文化 10分間、200×gで解離脊髄組織を含むチューブをスピンダウン。ニューロスフェア培養培地の1ミリリットルで上清と再懸細胞ペレットを取り外します（ 表2参照）。解離を促進するために、P200ピペット続いP1,000ピペットで粉砕します。 注：気泡を導入しないでください、これは、細胞生存率を減少させます。 血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を得ます。神経球培養培地10mlでT25フラスコ中の1×10 5 / 10mlを密度でプレート細胞。ニューロスフェアは、24を表示されるまで7日間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 ニューロスフェア解離 ニューロスフェアの文化を収集し、15 mLのチューブに移します。 10分間、200×gでスピン。背後に1ミリリットルを残して上清の大部分を削除します。細胞ペレットを再懸濁し、単一細胞に、神経球を解離するP1,000ピペットで粉砕します。血球計数器に移す解離した細胞を10μlおよび細胞数を取得します。 プレート1×10 5、96ウェルプレート（96ウェルプレートにF9 RARE-LacZのメッキについては、セクション5.1を参照）にF9 RARE-LacZのの1つのウェルにわたって神経球細胞を解離しました。プレートの複製として3ウェル。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 E8.5胚および脊髄神経球の5 RAアッセイ 96ウェルプレート中にF9 RARE-LacZのめっき 収穫E8.5胚またはニューロスフェアの解離の前にある日、RTで30分間、ウェルあたり0.2％ゼラチン100μlでコート96ウェルプレート。ゼラチン出て吸引し、蒸留水200μlで二回すすいでください。 ステップ2.2.2で詳述するようにトリプシン処理F9 RARE-LacZ細胞を10cm皿に維持しました。プレート1×10 5細胞/ウェルのF9-RARE LacZ細胞が、この時、G418を含まない培地を使用して。 （ – ごみの大きさに応じて、20 12〜）、ニューロスフェア（3ウェル/遺伝子型）と同様に三連での標準曲線（27ウエル）のための胚の共培養のための十分な井戸を準備します。 F9 RARE-LacZおよびE8.5胚または脊髄神経球の共培養 F9の上のセクション3.2およびプレートに詳述するように収穫の胚セクション5.1から96ウェルプレート中のRARE-LacZを。同様に、ステップ4.4で詳述したように96ウェルプレート中のF9 RARE-LacZの上部にニューロスフェア、プレートを解離します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 標準曲線を作成します アットの連続希釈によって、100 nMで、10 nMの、1 nMで、100ピコモル、10ピコモル、1ピコモル、100マッサ：、標準曲線を生成するには、次の濃度のオールトランスRA（AT-RA）溶液を調製するために、 F9 RARE-LacZの培地でRA株（ 表1参照）。 セクション5.1からF9 RARE-LacZの細胞にこれらの異なるで-RA濃度の100μLを加えます。未処理のF9 RARE-LacZの細胞のような負の対照を含むウェルを割り当てます。各RA濃度及び陰性対照ウェルの三連を準備します。 37℃で培養O / N及び5％CO 2。 注：F9 RARE-LacZ細胞は、オールトランスRAの様々な濃度に用量依存的な直線的に応答します。 RAアッセイ 標準曲線との共培養を含む96ウェルプレートのO / N培養後、培地を除去し、15分間2.5％グルタルアルデヒド（ 表2を参照されたい）、RT100μlを加えることによって、培養物を固定します。固定液を削除し、200μlの1×PBS、1回の洗浄あたり10分で二回洗浄します。 PBSを取り外しおよびLacZ洗浄液200μlで3回洗浄し、洗浄あたり10分（ 表2参照）。 3回目の洗浄の際に、ホイルに包まれた15mlチューブ中のX-gal染色溶液を調製する（ 表2参照）。必要とされているどのくらいの染色液を計算し、適切な量（200μL/ウェル）を準備します。 注：X-gal染色溶液は感光性です。調製後15分以内に染色液を使用します。 96ウェルプレートを保持するのに十分な大きさのプラスチック容器に蒸留水で湿らせたペーパータオルを置くことによって加湿チャンバーを準備します。 Xの200μLを加えます96ウェルプレートのウェルあたり-Gal染色液と加湿チャンバー内でプレートを配置します。 青色の沈殿物の開発を可能にするために、37℃で96ウェルプレートを含む加湿チャンバーをインキュベートします。 （ – 16〜12時間）E8.5胚のために、プレートO / Nインキュベートします。 8時間 – ニューロスフェア培養のために、4静置します。 OD 610とイメージングでの吸光度を読みます 発色反応後、LacZ染色溶液を除去し、200μlの1×PBSと交換してください。 RAに対するレポーター応答を定量するために、標準的なELISAプレートリーダーを用いて610 nmの吸光度を測定します。カメラを搭載した標準的な実体顕微鏡を用いた画像個々のウェル。 F9 RARE-LacZ細胞の6サブクローニング RAにF9 RARE-LacZのrResponseをチェック いずれの実験を開始する前に、RAに​​F9 RARE-LacZ細胞の応答をテストします。プレートF9 RARE-LacZのC96ウェルプレート中のellsは（セクション5.1を参照）、および1 nMの全トランスレチノイン酸（ステップ5.3を参照）を追加します。 37°CO / Nの加湿チャンバー内でインキュベートします。 顕微鏡を使用して青色の沈殿物の開発を可視化します。発色がウェルの細胞全体が均一でない場合（左図1Bを参照）、以下に詳述サブクローニングを行います。 F9 RARE-LacZ細胞のサブクローニング ステップ2.2.2で詳述するように10cmの皿で培養F9 RARE-LacZ細胞を分割します。代わりに、1：10の比率で、各コロニーは単一F9 RARE-LacZの細胞から生じるように分離されたコロニーの増殖を可能にするために、10cmの皿に1×10 5細胞/ 10ミリリットルの低播種密度をめっき。 2日後、30分間ウェル当たり0.2％ゼラチン500μlのとコート24ウェルプレートを。ゼラチン溶液を除去し、蒸留水500μlのウェルを2回すすぎます。 F9 RARE-LacZの細胞培養培地500μlに水を交換してください。 1つのウェルに滅菌P10ピペットチップおよび転送を使用してコロニーを選択してください。 24個々のコロニーを得るために、この24回を行います。 4日- 3、37℃、5％CO 2で培養。 2つの24ウェルプレートに個々のコロニーを分割します。文化の中で2日後、1 24ウェルプレートや文化O / Nの各ウェルにRAの1nMのを追加します。高い反応性をテストするためにセクション5.4で説明するようにLacZ染色を実行します。強力かつ均一な反応者を決定することは、十分に顕微鏡下で各色反応を可視化します。 強力なサブクローンの応答が決定されると、他の24ウェルプレートから対応する文化を展開します。また、10cmの皿にその植民地を拡大2.3節で詳述されるように、いくつかのバイアルを下に凍結し、他のすべてのコロニーを捨てます。 注：のみ元のコロニーの約4分の1は、高い反応性をもたらします。一般的に、サブクローニングの最初のラウンドは、均一なLacZ染色およびサブクローニングのその後のラウンドにはなりませんに行われる必要があります均一な強いレスポンダを達成。