צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב קריטי של פרוטוקול תחרות מין חיידקים זה שמבדיל אותו מאחרים, הוא הדגיר הלילה של המעכב לבודד לפני התוספת של לבודד המתחרה. המתח המעכב דורש תקופת הצמיחה הזו כדי לייצר תרכובות מעכבות. כמו המתח המתחרה הוא מעולף על גבי אותו המדיום, שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון את מלוא הפוטנציאל של המתח מעכב להפריע צמיחה של הזן המתחרה. כתוצאה מכך, assay זה משקף את מה שקורה עם הטבע; אחד לבודד מוקם במלואה בתוך גומחה, והשני חייב להיות מסוגל לנטרל כל משתני מעכבות תוכל לפלוש הנישה בהצלחה.
ישנם שני חלקים לפרוטוקול זה כי הם ככל הנראה כדי לגרום תוצאות שגויות אם ביצע באופן שגוי. ראשית, עיקור שלם של בקבוקי מאדה יכול להציג זיהום חיידקים לתוך assay. Incubation של המרק נהג לשטוף את הבקבוק מאדה בשלב 3.6 בתוך כלי סטרילי ניתן להשתמש כדי לאשר בקבוקים עוקרו לחלוטין. שטיפות נוספות בפתרונות חיטוי, כגון Virkon, ניתן להשתמש לפני בכביסה ב חומר ניקוי פעיל שטח, כמתואר בשלב 3.2, אם נדרש עיקור נוסף.
בשלב שני שעלולות לגרום לתוצאות שגויות הוא הדילול של זן המתחרה (שלב 6.1). אם הדילול אינו אופטימלי, מדידות ברורות של עיכוב לא ניתן לקבוע בקלות. Assay זו הוטבה באמצעות מבודד אף שונה כמו מעכבים-ייצור זנים על פני מגוון רחב של גראם חיובי ומינים גראם שליליים לעומת ס aureus SH1000 כמו 7,8 זן המתחרה. זה בהמשך נבדק באמצעות staphylococci coagulase השלילי השונה coagulase חיובי כמתחרת מעכבים-ייצור זנים. כאשר בודקים סוגים אחרים מאלה שתוארו לעיל כמתחרהזן, כמה אופטימיזציה של דילול עבור הבידוד עשוי להיות נחוץ.
אם ציוני בהירות להשתנות משמעותי בין חזרות, זה עשוי להיות נחוץ כדי לתקנן את בידוד הזן מתחרה על ידי הגדרת אותו צפיפות אופטית ספציפית. עם זאת, זה יגדיל את הזמן assay לוקח להקים, והוא צפוי להפחית את מספר הזנים אפשר לעבד לכל ניסוי. ראייה והתאמת התרבות כדי OD המתאים באמצעות תקן מק 'פרלנד עשויה לספק אלטרנטיבה מהירה.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא שזה זה יכול להיות מיושם רק לחיידקים culturable. זו הסיבה מדוע מחקרים רבים משתמשים רצף 16S rRNA לחזות אינטראקציות הרחקה תחרותיות 3,4,13. עם זאת, טכניקות גנטיות metagenomic יכול להבחין רק לחברי הקהילה ברמת המין, ו / או לא מדברים על וריאציה תכונה intraspecific בפרט. אפשר למסך את שיוכה של particulגן ar המקודד תכונה עם נוכחות או היעדר של 5 מינים של חיידקים, אך זה דורש ידע מראש של גן עשוי להיות מזוהה עם הרחקה של מינים.
שיקול בטיחות של טכניקה זו הוא כי, בשל הדור אירוסול של חיידקים, ניתן להשתמש בו רק במעבדות עם ארון בטיחות ברמה 2, או עם אמצעי בטיחות דומה. ישנן טכניקות חלופיות כדי לבדוק לתחרות בין בידודים המסבירים וריאצית תכונת intraspecific, ואינו מייצרים אירוסולים של חיידקים. שיטה אחת כזו היא assay אנטגוניזם סימולטני 2. בשיטה זו, בידוד של תבדיד אחד משתרע על צלחת אגרה, וכן בידוד לבודד שני הוא הבחין או נדקר על גבי ברגע הראשון התייבש. זה יפיק בסביבה שבה הזנים נמצאים בתחרות ישירה (אנטגוניזם סימולטני), הן מתחרות לייצר תרכובות מעכבות ו scavenge מזינים ראשון. advantagדואר של assay עיכוב צמיחה נדחה על פני assay אנטגוניזם סימולטני הוא כי לבודד המעכב צריך תמיד את היתרון התחרותי של מוקמות באופן מלא לפני הפלישה של לבודד המתחרה. זהו מהורהר יותר של מה קורה בסביבה, כמו ברוב הנישות, לבודד אחד שיוקם לפני זן אחר הוא הוסיף, במקום שני מבודדים להתווסף באותו הזמן 8.
חלופה נוספת להימנע דור אירוסול של חיידקים יהיה להוסיף המתחרה לבודדת אגר עליון, אשר יכולה להיות שפך ולא מרוססת על לבודד המעכב. עם זאת, היקף אגר העליון הוסיף היה צריך להיות כ 3 מ"ל כדי להבטיח אפילו כיסוי של הצלחת. בתוך הכרך הזה, לבודד המתחרה לא יהיה גדל באותו מדיה כמו לבודד המעכב, ולכן לא יכבד סובל מזינים מופחתים. המתחרה הייתה גם לא להיות בקשר ישיר עם כל תרכובות מעכבות until הם מתפזרים לתוך אגר העליון. כזה assay לא ניתן לתאר עיכוב נדחה או אנטגוניזם סימולטני.
שיטה דומה כבר השתמשה בעבר כדי להעריך את רמות התנגדות Bacitracin בקרב קליני ס aureus מבודד 10. ההבדל העיקרי בין הפרוטוקול המתואר כאן וכי שתואר על ידי 10, הוא הזנים המתחרים המסווגים רק האחרון כרגיש (להשלים בהירות inhibition- להבקיע 0) או עמידים (חלקיים ללא בהירות inhibition- להבקיע 1-5). את assay עיכוב צמיחה הנדחה יכול אפוא לשמש גם למסך רמות התנגדות ליצרני antimicrobials מסוים, או אפילו לחפש antimicrobials רומן פעיל נגד פתוגנים עמידים רבים-סמים.
הועלתה השערה כי microflora המארח יכול להיות מניפולציה כדי לחסל רצויה של לקהילת החיידקים 9. יישום של corynebacteria או Staphylococcus epidermidis כבר הוכח לחסל ס קולוניזציה aureus ב nares ב חלק ניכר של האוכלוסייה 11,12. מחקרים לתוך זנים ספציפיים שיכול להדיר אנשים רצויים תחרותית של הפלורה המארח, באמצעות טכניקות כגון זה המתואר כאן, ולכן עשויים להוביל רפוי בעתיד.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM ממומנת על ידי הפרסים BBSRC-IPA עם יוניליוור Plc (BB / L023040 / 1). מרשעת מכוערת ממומנת על ידי משרד סעודי תעודת סטודנט לדוקטורט השכלה גבוהה.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
Referencias
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
