递延生长抑制试验来量化竞争性细菌来源的抗菌剂的影响

下面的方法适合用7,8抑制剂生产菌株，以测试应变竞争对手。 注：该协议涉及气溶胶的产生与细菌培养。这只能在包含的空间与执行本地认可的安全方面的考虑来执行。一个2级安全柜内到琼脂平板培养物喷洒将最小化的琼脂平板的污染和周围环境。这也将防止喷射细菌雾化吸入的研究者，这是一个主要问题，如果研究者使用包含级别2的生物体。适当的个人防护设备必须佩戴。围绕培养皿的区域最好与一次性吸湿组织覆盖。使用UV光喷雾消毒后建议。 1.准备琼脂平板准备脑心脏浸液（BHI）琼脂按照给马努厂家的说明。 高压灭菌的BHI琼脂在121℃，15根据高压釜制造商的建议psi的20分钟，或者，进行消毒。 倾灭菌BHI琼脂15毫升分装到无菌培养皿中，并允许它设置。 注：确保要使用的每一个琼脂平板内测定从琼脂的相同库存始发，并且有在每个板中的相同量的琼脂。这限制了速效养分和板材允许可比性的抑制剂扩散的可变性。 2.准备无菌肉汤根据制造商的说明准备BHI肉汤。 BHI添加10毫升分装到28毫升玻璃奶瓶普遍。 ，15磅20分钟，或根据高压釜制造商的建议高压釜在121℃的BHI液体培养基，灭菌。 注：确保在试验中使用的所有肉汤同一批肉汤AUT的起源同时以限制的营养成分，它可能导致结果变异变异oclaved。 3.准备无菌蒸发器瓶（S） 拆开vapourizer瓶。 喷雾5％的表面活性清洗剂通过vapourizer，消除内部的污染物，泡vapourizer瓶子，盖子和vapourizer在5％的表面活性清洗剂过夜。 注：手套和适当的个人防护装备应处理的表面活性剂清洗时使用。 在干燥无菌空气流罩蒸发器，盖子和瓶子。 把瓶子装满70％的乙醇，重新连接vapourizer并通过vapourizer喷些乙醇。 放在蒸发器盖子，里面直到使用乙醇储存。 使用，无菌冲洗瓶子用无菌BHI肉汤，并通过vapourizer喷汤前夕。 注意：这可以防止乙醇AFF阿拉斯加入到瓶子中6.3节接种。 4.准备细菌过夜培养（S） 条纹的竞争者和抑制剂株上的无菌BHI琼脂平板上，并在37°C孵育需氧大约18小时（过夜）。 注意：此板产生时保存在4℃下，可以被用于在同一周内多次重复细菌的库存。 接种10毫升无菌BHI肉汤的与所需的竞争者细菌菌株的28毫升普遍瓶子内的单个菌落。 通过在轨道摇床以250rpm摇动孵育在37℃的普遍瓶需氧过夜。 5.抑制剂生产隔离现货文化在第4节准备过夜培养（S）。 确保琼脂平板完全干燥后，盖上盖子不结露，在接种前（ 例如 ，通过培育解放军德在37℃下60分钟）;这防止了接种物从接种部位穿过该板传播。 吸移管25微升过夜培养物到琼脂平板的中央。避免完全放开吸管柱塞，防止气泡横跨琼脂喷文化。 允许培养在室温下干燥，以限制文化的传播。在37℃下孵育琼脂平板需氧过夜。 6.准备测试竞争者应变的喷雾接种（S） 如第4稀释的过夜培养10倍的BHI肉汤中所述，得到约4×10 6 CFU毫升-1制备过夜培养，并悬浮液的OD 600 0.3±0.05的。 注：10倍稀释不会放弃4×106 CFU毫升-1所有的细菌种类，通 ​​过传播板之间1×10系列稀释计算所需的稀释倍数<s达> -1 -1×10 -6。 倒入稀释文化带入无菌塑料香水瓶喷雾器。 注：总体积必须更对于被喷琼脂板的数量比是必要的。大约每板250μl的是适合于9厘米直径的陪替氏培养皿。 7.递延生长抑制试验通过各蒸发器的瓶子的喷雾的培养，以确保培养物在喷雾机构喷涂到琼脂之前加载。 从约15厘米的琼脂上面的距离，喷约250稀释的培养的微升（典型50毫升汽化器3喷雾剂）在整个琼脂表面。在37℃下孵育琼脂平板需氧过夜。重复具有相同数量的喷雾剂的其它板。 8.递延解读生长抑制试验结果测量喷雾competi的生长抑制区器菌株（ 图1A – C，“X”为“X”）以毫米为单位，减去抑制剂生产者的中央点的直径（ 图1A – C，“Y”为“Y”）。 注： 图1E表示这个数据是如何被呈现记录清晰度得分抑制区。 注：这表示观察到抑制程度。实例示于图1A – D，可用于标准化的菌株中的代表性结果部分的建议。以下尺度可用于清晰度评分：0清晰度评分来描述竞争者菌株的生长的完全抑制的区域。 1分来形容的增长几乎完全抑制的区域，与目前在空地的区域只有个别殖民地。 2分来形容降低经济增长的可见区域，这个区域内的增长是骗子流利或接近汇合但> 50％密度减少。 3分来形容只有最小的增长减少，生长汇合并低于50％降低，区域仍然是可见和可衡量的。 4分来形容生长没有明显的抑制作用。将5得分来描述的竞争者菌株的生长在测试抑制剂生产菌株的接近而增加。参见图1中的例子。这些分数是主观的实验者。 9.重复至少在生物一式三份重复试验，以确定获得的结果的可重复性。 注意：如果重复在不同的天进行的，进行测量，并在4℃下从温育中取出后立即得分板，然后或者商店板或将其废弃之前采取板的高品质的照片。存储或板的照片，使不同天之间的结果易于比较，T他是整个天/实验证实可重复性的得分尤为重要。注意，在板的存储具有改变的结果的可能性。 注：对于清晰的照片代替板直立没有他们在漫射光的面积的哑光黑色的背景盖，使用高分辨率相机（≥8MP）能够专注于物体靠近镜头（微距模式）。或者，用反式照明部分凝胶成像仪设置为白色光可以生产出高品质，高重现性的图像。